茶樹離體培養(yǎng)類型及其應(yīng)用研究進(jìn)展

田奧磊，高俊杰，李丹丹，楊曉芳，劉建福*，黃壽生，張 斌

(1.華僑大學(xué) 園藝系，福建 廈門 361021； 2.泉州市農(nóng)業(yè)局種植業(yè)管理站，福建 泉州362000；3.福建省武夷山市仙茗巖茶廠，福建 南平 353000)

茶樹離體培養(yǎng)類型及其應(yīng)用研究進(jìn)展

田奧磊1，高俊杰2，李丹丹1，楊曉芳1，劉建福1*，黃壽生3，張 斌3

(1.華僑大學(xué) 園藝系，福建 廈門 361021； 2.泉州市農(nóng)業(yè)局種植業(yè)管理站，福建 泉州362000；3.福建省武夷山市仙茗巖茶廠，福建 南平 353000)

茶樹離體培養(yǎng)在茶樹育種、種質(zhì)創(chuàng)新和茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。綜述了茶樹腋芽、莖段、茶籽、花藥、葉片和愈傷組織等離體培養(yǎng)類型的相關(guān)研究進(jìn)展，闡述了茶樹離體培養(yǎng)在離體快繁、胚狀體誘導(dǎo)、種質(zhì)離體保存、次生代謝產(chǎn)物生成等方面的應(yīng)用，并展望了茶樹離體培養(yǎng)未來(lái)的發(fā)展前景，為茶樹育種和生物技術(shù)研究提供參考。

茶樹； 離體培養(yǎng)； 應(yīng)用

茶樹具有悠久的栽培歷史，但由于常規(guī)育種技術(shù)的局限性，生產(chǎn)上缺乏低咖啡堿、高兒茶素和高茶氨酸等符合人們消費(fèi)需求的優(yōu)良品種。植物離體培養(yǎng)技術(shù)既可用于大量生產(chǎn)優(yōu)良無(wú)性系植株，又可打破種屬間的界限，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和等障礙，對(duì)于開展茶樹種質(zhì)資源的保存、新品種的培育及種性改良等方面的研究具有重要意義[1]。植物離體再生技術(shù)的日益成熟和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，為培養(yǎng)茶樹品種開辟了新的途徑。20世紀(jì)60年代，英國(guó)劍橋大學(xué)采用茶樹幼嫩莖段研究離體咖啡堿的合成，從而開創(chuàng)了茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)研究的新篇章[2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)茶樹不同類型外植體培養(yǎng)成功建立茶樹再生培養(yǎng)體系，在茶樹離體快繁、種質(zhì)資源保存、種質(zhì)創(chuàng)新、胚狀體誘導(dǎo)和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等方面取得較大成就[3]。從離體培養(yǎng)類型方面對(duì)目前茶樹離體培養(yǎng)研究及其應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在為茶樹育種和生物技術(shù)研究以及茶樹種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

1 茶樹離體培養(yǎng)類型

1.1 腋芽培養(yǎng)

腋芽培養(yǎng)為離體培養(yǎng)中常用的類型，在連續(xù)培養(yǎng)中能產(chǎn)生更多的叢生芽，且發(fā)育生長(zhǎng)得較好，具有穩(wěn)定的遺傳特性和較高的繁殖系數(shù)。茶樹實(shí)生苗、春季新梢等適宜的外植體均能促進(jìn)茶樹腋芽的萌發(fā)，其生理狀態(tài)對(duì)其成苗及成苗后的生長(zhǎng)具有重要作用[4]。袁地順等[5]以福鼎大毫、福云6號(hào)健壯的幼嫩芽葉進(jìn)行培養(yǎng)，3周左右便在切口表面產(chǎn)生了肉眼可見的愈傷組織。李家華等[6]研究表明，6-BA和2,4-D能促進(jìn)大葉種茶樹腋芽形成單芽。譚和平等[7]以茶樹腋芽作為外植體，建立快速繁殖技術(shù)體系，離體培養(yǎng)10 d，茶樹腋芽尖即膨大，7～8周后誘導(dǎo)出芽且部分出現(xiàn)叢芽。陳澤雄等[8]也建立了渝茶1號(hào)腋芽離體培養(yǎng)與植株再生體系，誘導(dǎo)率達(dá)71.1%，增殖系數(shù)達(dá)3.37，生根率達(dá)55.6%。韋景楓等[9]對(duì)古茶樹的腋芽誘導(dǎo)分化、增殖及生根等組培技術(shù)進(jìn)行了研究，確定添加6-BA和IBA適宜腋芽的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)，生根率達(dá)到90%。雷攀登等[10]系統(tǒng)研究了腋芽離體培養(yǎng)技術(shù)體系，分析了影響腋芽培養(yǎng)的各種因素，并建立了茶樹離體增殖和再生體系。因此，腋芽培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生與外植體的生理狀態(tài)有關(guān)，激素種類對(duì)腋芽增殖與分化也起著重要作用。

1.2 莖段培養(yǎng)

莖段是被廣泛用于離體培養(yǎng)的外植體，主要應(yīng)用于離體快繁和建立試管苗無(wú)菌體系。采用莖段培養(yǎng)可以在短期內(nèi)大大提高繁殖率[11]，在茶樹育種過(guò)程中可以縮短育種年限。茶樹的莖段組織培養(yǎng)最早見于茶樹莖切片的愈傷組織誘導(dǎo)[12]，且試驗(yàn)證明，橫切莖段所獲得的愈傷組織誘導(dǎo)率最大[2]。Seran等[13]采用茶樹莖節(jié)培養(yǎng)出體細(xì)胞胚狀體，并建立了完整的茶樹再生體系。程柳[14]認(rèn)為，于5、6、9月時(shí)采摘的半成熟新梢的未木質(zhì)化部位為莖段最佳離體材料。宋麗莎等[15]以都勻毛尖茶半木質(zhì)莖段為外植體成功進(jìn)行了芽誘導(dǎo)和增殖。王云[16]則以水仙大葉茶樹苗的莖段和莖尖為外植體，獲得了莖段愈傷組織。袁毅君等[17]認(rèn)為，幼莖誘導(dǎo)愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA+NAA+2,4-D，但茶樹幼莖誘導(dǎo)出的愈傷組織比較硬，優(yōu)點(diǎn)是誘導(dǎo)時(shí)間短、誘導(dǎo)率較高[18]。劉德華等[19]以成齡茶苗嫩梢為材料進(jìn)行莖分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，莖段分化后，在不同組分培養(yǎng)基上交叉培養(yǎng)比在單一培養(yǎng)基上維持分化能力的時(shí)間長(zhǎng)。張婭婷等[20]用藪北茶伴有腋芽的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，最適的芽增殖培養(yǎng)基和生根壯苗培養(yǎng)基分別為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA和1/4MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+0.01 mg/L Al3+。楊亞萍[21]研究表明，莖段較葉片更適宜愈傷組織和根的誘導(dǎo)，以帶腋芽的莖段或以此誘導(dǎo)的整塊愈傷組織為轉(zhuǎn)化體更易獲得轉(zhuǎn)化苗。因此，靠近茶樹莖尖的部位分化再生能力強(qiáng)，離體培養(yǎng)更容易成功，這與茶樹莖段的木質(zhì)化程度有關(guān)。此外，培養(yǎng)基成分對(duì)莖段分化有較明顯的影響。

1.3 葉片培養(yǎng)

葉片培養(yǎng)已經(jīng)成為葉形態(tài)建成研究和組織快繁的重要手段，葉片是進(jìn)行愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)的常用外植體。1989年，以葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，首次獲得完整植株[22];此后，在水仙大葉茶樹[6]、福建大白茶[23]、清遠(yuǎn)筆架茶[24]等茶樹上，成功誘導(dǎo)出葉片愈傷組織。葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生黃綠色、松軟易碎的愈傷組織，其進(jìn)一步誘導(dǎo)出根[25]。歐少云等[26]用清遠(yuǎn)筆架茶嫩葉作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)86%。袁毅君等[17]獲得甘肅康縣地方茶樹幼葉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA+NAA+KT，幼嫩葉切片的誘導(dǎo)率高于全葉，但生長(zhǎng)狀況較差[5]。對(duì)茶樹葉片誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行細(xì)胞組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞起源于葉片中脈[27]。嚴(yán)學(xué)成等[28]用茶樹葉片誘導(dǎo)出胚狀體和器官，進(jìn)一步形成小植株。因此，葉片的發(fā)育程度和來(lái)源等因素影響著葉片的生理狀態(tài)，從而影響其再生能力。葉片離體再生技術(shù)為茶樹器官發(fā)生、胚狀體誘導(dǎo)和遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)支撐，從而為茶樹種質(zhì)創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1.4 茶籽培養(yǎng)

國(guó)內(nèi)外利用茶樹種子的某些組織作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)、分化植株的研究進(jìn)展很快。黃燕芬等[29]建立的茶樹種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+6-BA+IBA+YE或改良的ER+6-BA+NAA，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2ER+IBA，發(fā)根率達(dá)80%。未經(jīng)低溫貯藏的茶籽外植體不定胚的發(fā)生率高于經(jīng)4 ℃貯藏的發(fā)生率，并且2,4-D對(duì)不定芽的分化有抑制作用[30]。自然雜交茶樹種子經(jīng)4 ℃冷藏或在培養(yǎng)基中添加噻苯隆(TDZ)有利于不定芽、不定胚分化，其中，不定芽從子葉柄、子葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織上發(fā)生，而不定胚主要從子葉柄、子葉上發(fā)生[31]。同時(shí)，芽對(duì)不定胚的發(fā)生具有抑制作用，畸形胚分化率從子葉柄至子葉片依次增高，畸形胚增殖力強(qiáng)，能分化正常胚[32]。茶樹種子培養(yǎng)與其成熟度有關(guān)，茶籽采摘后立即培養(yǎng)，不定胚分化率最高。李曉東等[33]以不同成熟度的茶籽作為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，獲得體細(xì)胞胚和二級(jí)體胚。許益娟[34]研究表明，茶樹未成熟胚的接種方式為胚向上，培養(yǎng)基為ER+NAA+6-BA+GA3時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)98.9%。茶籽一般有短暫的后熟期，其后熟過(guò)程可能是內(nèi)在生理物質(zhì)和胚性狀態(tài)發(fā)生變化的過(guò)程，某些雙極性細(xì)胞轉(zhuǎn)變成單極性細(xì)胞，有利于胚的分化。因此，茶籽較其他部位更容易獲得完整植株，形成離體培養(yǎng)體系。

目前，茶樹幼胚、雜種幼胚和成熟胚均可通過(guò)人工培養(yǎng)成功誘導(dǎo)分化，并形成植株。茶樹未成熟胚可成功誘導(dǎo)出合子胚、不定胚及不定芽，且能較好地誘導(dǎo)生根[35]。王玉書等[36]建立了未成熟胚離體培養(yǎng)技術(shù)，并成功培養(yǎng)獲得一批試管苗。周健等[37]研究表明，茶樹幼胚的萌發(fā)需要生長(zhǎng)素的刺激作用，細(xì)胞分裂素對(duì)幼胚萌發(fā)具有抑制作用；80%以上的幼胚可以發(fā)育成熟并萌發(fā)成苗。蔡海云等[38]進(jìn)行茶樹品種農(nóng)抗早的成熟胚離體培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率為97%，愈傷組織的芽分化率為14.2%，幼苗的根分化率為5%。劉本英等[39]通過(guò)對(duì)云南大理茶(♂)與福鼎大白茶(♀)種間雜交F1代雜種幼胚進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得福鼎大白茶×云南大理茶雜交組合的3個(gè)幼胚組培苗株系。丁力等[40]研究表明，2,4-D和6-BA能誘導(dǎo)福建茶種子的胚產(chǎn)生愈傷組織，NAA和玉米素有利于福建茶愈傷組織的生長(zhǎng)和繼代培養(yǎng)。未成熟胚具有更高的分化能力，幼胚誘導(dǎo)愈傷組織率高，但分化率很低。茶樹種胚離體培養(yǎng)技術(shù)為茶樹種質(zhì)資源的保存提供了新途徑，對(duì)有性雜交或遠(yuǎn)緣雜交種子繁殖具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

子葉中各部位的分化能力都較強(qiáng)。黃燕芬等[41]采用改良的ER+6-BA+NAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)子葉柄產(chǎn)生愈傷組織并分化出芽。菽北茶雜交種子的子葉柄可不經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)，直接形成完整植株[42]。種子中不成熟的子葉也能誘導(dǎo)獲得植株[43]；而且胚狀體主要發(fā)生在子葉柄和子葉片隆起的地方，其發(fā)生率與光照強(qiáng)度有關(guān)[44-45]。劉德華等[46]進(jìn)行茶籽下胚軸培養(yǎng)，并獲得完整的植株，認(rèn)為下胚軸容易形成叢生芽。

1.5 花藥培養(yǎng)

茶樹是異花授粉植物，很難通過(guò)自交獲得純系，給茶樹遺傳育種工作和理論研究帶來(lái)很大障礙?；ㄋ幣囵B(yǎng)在植物離體培養(yǎng)中占有重要地位。通過(guò)花藥培養(yǎng)可以得到單倍體植株，在雜交育種、抗性育種與誘變育種中具有重要意義，并能克服遠(yuǎn)緣雜交育種中的不育性和分離性。茶樹花藥培養(yǎng)開始于1968年，盛尾清以茶樹花藥誘導(dǎo)出愈傷組織并分化出根[47]。1974年陳振光等對(duì)福云7號(hào)茶樹花藥進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，獲得根、莖、葉完整的植株，并進(jìn)行了倍性鑒定[48]，這是茶樹花藥作外植體首次成功獲得植株。郭玉瓊等[49]誘導(dǎo)鐵觀音茶樹花藥愈傷組織，證明花藥愈傷組織具備合成茶多酚的能力。近年來(lái)，茶樹花藥愈傷組織培養(yǎng)研究較少，且采用的茶樹品種中，僅福云7號(hào)花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)形成了植株[48]。影響花藥培養(yǎng)的因素主要包括外植體基因型和激素種類。外植體的基因型影響花藥培養(yǎng)的出愈率和分化率，培養(yǎng)基中2,4-D濃度與花藥體細(xì)胞愈傷組織誘導(dǎo)率呈正相關(guān)?；ㄋ幣囵B(yǎng)所獲得的植株不是單純的單倍體，而是混倍體。而花粉培養(yǎng)則可以完全排除花藥組織的干擾，使誘導(dǎo)形成的植株全部為單倍體。但是花粉培養(yǎng)的技術(shù)難度更大，目前尚未見有關(guān)茶樹花粉培養(yǎng)的報(bào)道。

1.6 愈傷組織培養(yǎng)

愈傷組織培養(yǎng)是植物離體培養(yǎng)最常用的培養(yǎng)形式。茶樹離體培養(yǎng)中不同品種的葉片、幼莖、種胚、子葉柄等外植體通過(guò)脫分化可誘導(dǎo)形成愈傷組織。陳志輝[50]研究表明，葉片是誘導(dǎo)福鼎大白茶愈傷組織的最好外植體，且通過(guò)多次繼代培養(yǎng)可擴(kuò)大愈傷組織的繁殖。陳玉玲等[51]發(fā)現(xiàn)，幼莖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA+2,4-D，幼莖愈傷組織的誘導(dǎo)率高于葉片愈傷組織。陳瑛等[52]研究表明，添加6-BA+IAA 或6-BA+IAA+TA有利于茶愈傷組織的生長(zhǎng)。丁力等[40]研究表明，2,4-D+6-BA能較好地誘導(dǎo)福建茶種子胚愈傷組織產(chǎn)生，NAA+ZT有利于愈傷組織生長(zhǎng)和繼代培養(yǎng)。申剛等[53]研究表明，高寨貢茶莖段和葉片愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA+2,4-D+ZT+IBA。王貞紅等[54]研究表明，培養(yǎng)基MS+2,4-D+6-BA+NAA適宜易貢川茶、重慶川茶、清馨烏龍、福鼎大白茶和巴渝特早幼苗莖段愈傷組織的誘導(dǎo)。黃紅芳等[30]研究表明，改良MT培養(yǎng)基添加6-BA和NAA可較好地誘導(dǎo)子葉柄產(chǎn)生愈傷組織。在茶樹愈傷組織的形成過(guò)程中，首先啟動(dòng)的是葉肉中小葉脈周圍以及主脈的薄壁細(xì)胞，脫分化后進(jìn)行分裂，形成分生細(xì)胞團(tuán)，繼而形成愈傷組織[55]。陳志輝[56]研究發(fā)現(xiàn)，黃觀音幼籽愈傷組織在分化生長(zhǎng)過(guò)程有大量綠色小突起，并同時(shí)分化出根。在愈傷組織的研究中，不同品種茶樹的不同部位作為外植體所需要的激素類型有所不同。因此，在誘導(dǎo)愈傷組織及采用愈傷組織誘導(dǎo)根莖時(shí)，激素的類型與配比顯得格外重要。茶樹愈傷組織培養(yǎng)不僅是茶樹離體快繁的新手段，同時(shí)也是茶樹品種改良、種質(zhì)保存和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的理想途徑。

2 茶樹離體培養(yǎng)的應(yīng)用

2.1 離體快繁

茶樹通過(guò)離體快繁不僅可以提高繁殖系數(shù)，而且能最大限度地保持品種的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)新品種和良種快速推廣有重要價(jià)值。離體快繁主要利用的是組織培養(yǎng)的增殖培養(yǎng)、微繁殖和體細(xì)胞胚誘導(dǎo)等技術(shù)。孫仲序等[57]用茶樹莖段作為外植體，經(jīng)過(guò)3次繼代培養(yǎng)，得到47株苗。快速繁殖效率與增殖繼代頻率和增殖率密切相關(guān)，增殖率取決于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)和激素配比[58]。楊娟等[59]認(rèn)為，茶樹組培苗繼代培養(yǎng)基中NH4NO3質(zhì)量濃度為1.24 g/L有利于組培苗生長(zhǎng)。鄔秀宏等[60]研究表明，6-BA/NAA濃度比值為7.5～15有利于渝茶1號(hào)繼代苗生長(zhǎng)，添加GA3促進(jìn)增殖和生長(zhǎng)。周健等[61]采用BA+NAA+GA3激素組合進(jìn)行茶樹組培快繁，茶樹組培苗的增殖率可達(dá)2.75倍左右。譚和平等[7]以不同茶樹品種的腋芽探索茶樹組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，結(jié)果表明，采用6-BA+IAA激素組合培養(yǎng)7～8周即可誘導(dǎo)出芽且部分出現(xiàn)叢芽，增殖培養(yǎng)基僅用6-BA可實(shí)現(xiàn)增殖倍數(shù)3.21。周國(guó)蘭等[62]采用湄潭苔茶地方良種帶腋芽莖段進(jìn)行組培快繁，結(jié)果表明，6-BA+NAA+GA3激素組合適宜芽增殖培養(yǎng)。Sarathchandra等[63]用50個(gè)莖節(jié)外植體培養(yǎng)獲得36 000多株茶苗，建立了實(shí)用微繁殖方法。Manicel[64]認(rèn)為，腋芽是快繁較好的外植體。張凌云等[65]和曾亮等[66]分析了不同階段茶樹的微繁殖技術(shù)，證實(shí)微繁殖技術(shù)可以使用盡可能少的材料培育出更多的植株。目前，茶樹組培的生根問(wèn)題也基本解決。易鑫等[67]在篩選碧螺春生根培養(yǎng)基時(shí)發(fā)現(xiàn)，IBA質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/L時(shí)生根效果最佳。黃曉娜等[68]證實(shí)了金花茶組培苗試管外生根的可行性。于旭東等[69]建立了海南腎茶離體快繁高效體系，降低了組培苗的單瓶成本。因此，利用離體快繁技術(shù)快速獲得大量植株已經(jīng)成為茶樹種苗工業(yè)化生產(chǎn)的必然趨勢(shì)。

2.2 種質(zhì)資源離體保存

茶樹種質(zhì)資源是開展茶樹種質(zhì)資源創(chuàng)新、進(jìn)行茶樹生物工程技術(shù)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)，其保存的質(zhì)量和數(shù)量對(duì)茶樹育種研究有著深遠(yuǎn)影響。茶樹組織培養(yǎng)為茶樹種質(zhì)資源保存提供了新途徑。目前，利用茶樹子葉、成熟胚、未成熟胚、莖尖、葉片、花粉等外植體培養(yǎng)植株的技術(shù)基本成熟，這些外植體均可成為茶樹種質(zhì)保存的理想材料。王立等[70]以14個(gè)有性系茶樹品種的未成熟胚和15個(gè)茶樹品種的莖段培養(yǎng)形成離體試管培養(yǎng)物，并成功保存4～10 a，而且建立了反復(fù)增殖系統(tǒng)，試管植株的表型、農(nóng)藝性狀、芽葉物候期、成茶品質(zhì)等遺傳穩(wěn)定；此外，試驗(yàn)證實(shí)，在培養(yǎng)基中添加化學(xué)抑制劑并結(jié)合低溫弱光培養(yǎng)條件可以延長(zhǎng)繼代培養(yǎng)時(shí)間，從而增加種質(zhì)保存期。李振剛[71]研究了烏龍茶茶樹種質(zhì)的離體保存方法，結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加甘露醇，茶樹試管苗存活率高，添加蔗糖、PP333和ABA適宜于長(zhǎng)期離體保存的繼代培養(yǎng)，證實(shí)滲透調(diào)節(jié)劑和生長(zhǎng)抑制劑對(duì)茶樹試管苗起到限制性離體保存作用。楊素娟等[72]認(rèn)為，花粉含水量約10%時(shí)可以在液氮中長(zhǎng)期保存。Kuranuki等[73]采用玻璃化技術(shù)研究了莖尖的超低溫保存，通過(guò)包裹/脫水進(jìn)行超低溫冷藏，芽形成率達(dá)到40%。劉亞軍等[74]采用茶葉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞玻璃化法超低溫保存優(yōu)良茶細(xì)胞系，建立的茶葉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞玻璃化超低溫保存的冷凍程序?yàn)轭A(yù)培養(yǎng)、PVS2冰浴裝載、PVS2冰浴脫水和40 ℃復(fù)溫解凍，細(xì)胞存活率達(dá)到76%。隨著分子生物技術(shù)的應(yīng)用，種質(zhì)資源保存將更加容易；同時(shí)，通過(guò)離體培養(yǎng)建立茶樹基因庫(kù)可使一些珍貴的遺傳材料得以長(zhǎng)期保存。

2.3 茶樹胚狀體誘導(dǎo)

體細(xì)胞可以誘導(dǎo)形成胚狀體，為細(xì)胞離體培養(yǎng)開拓新的技術(shù)領(lǐng)域，并被廣泛應(yīng)用于植物再生體系。同時(shí)，通過(guò)體細(xì)胞獲得優(yōu)良變異，再通過(guò)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的途徑形成完整植株，培育出新品種，為現(xiàn)代常規(guī)育種提供了新方法。顏慕勤等[75]以茶樹子葉基部和子葉柄為材料誘導(dǎo)形成胚狀體，證實(shí)胚狀體起源于子葉表皮細(xì)胞，在胚胎發(fā)生的最初分隔方式上與合子胚不同，但發(fā)育過(guò)程與合子胚一致。胚狀體分化和小植株形成受到植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)控。莊承紀(jì)等[76]研究表明，茶花組織培養(yǎng)中6-BA和NAA能誘導(dǎo)子葉形成胚狀體，其胚狀體同樣起源于子葉的表皮細(xì)胞，且能長(zhǎng)成苗并不斷增殖，最終形成正常植株；此外，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，液體振蕩培養(yǎng)能促進(jìn)胚狀體根的生長(zhǎng)和莖的發(fā)育。陳曉玲等[77]研究了茶樹體細(xì)胞胚的產(chǎn)生方式及形態(tài)，結(jié)果表明，茶樹體細(xì)胞胚直接發(fā)生于子葉柄處，或通過(guò)產(chǎn)生胚性愈傷組織間接發(fā)生；切片觀察發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚中細(xì)胞小且排列緊密、細(xì)胞質(zhì)濃、有若干個(gè)分生區(qū)域且具有分生能力。杜克久等[78]利用云南大葉茶胚性細(xì)胞系的懸浮培養(yǎng)物，建立了高頻率同步化體細(xì)胞胚發(fā)生及體胚苗形成體系，并證實(shí)體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程與合子胚的形態(tài)發(fā)生過(guò)程相似，且ABA有利于形成高質(zhì)量體細(xì)胞胚。王毅軍等[79]采用6-BA+IAA+GA3誘導(dǎo)出茶樹葉片愈傷組織胚狀體，切片觀察發(fā)現(xiàn)，胚狀體起源于愈傷組織表層及其內(nèi)部的單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)，其發(fā)育順序與合子胚大致相似，經(jīng)球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚階段，但常出現(xiàn)畸形胚。劉德華等[80]發(fā)現(xiàn)，6-BA/IBA比值較低時(shí)，可提高畸形胚的發(fā)生率，GA3促進(jìn)畸形胚的形成；胚狀體主要發(fā)生在子葉柄和子葉片的隆起處。培養(yǎng)條件中低光照強(qiáng)度可以提高子葉片胚狀體的分化率，降低子葉柄胚狀體分化率，但黑暗條件會(huì)增加子葉片畸形胚的轉(zhuǎn)化率[80]。

2.4 次級(jí)代謝產(chǎn)物生成

茶樹是一種富含多種次生代謝產(chǎn)物的植物。茶多酚、兒茶素、咖啡堿、茶氨酸等物質(zhì)為茶樹的主要次生代謝物。如何開發(fā)利用這些天然產(chǎn)物已成為近年來(lái)茶葉科學(xué)的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。利用組織培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物是茶樹細(xì)胞工程研究的一個(gè)重要領(lǐng)域[81]，也是解決資源不足的重要途徑。

茶樹愈傷組織中的茶氨酸積累量與茶樹品種有關(guān)[82]。Matsuura等[83]通過(guò)篩選茶樹愈傷組織得到含量較高的茶氨酸，茶樹愈傷組織中的茶氨酸含量取決于細(xì)胞生長(zhǎng)速度，與愈傷組織生長(zhǎng)量呈顯著正相關(guān)，茶氨酸的最佳收獲時(shí)間為培養(yǎng)后24～28 d。華萍等[84]對(duì)婺源綠茶愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，茶氨酸積累高峰期為培養(yǎng)19～22 d。成浩等[85]研究發(fā)現(xiàn)，在茶樹細(xì)胞的一個(gè)培養(yǎng)周期中，茶氨酸累積高峰出現(xiàn)在第11天左右，每10 d更換培養(yǎng)基則培養(yǎng)細(xì)胞茶氨酸合成能力可維持至第30天左右。呂虎等[86]進(jìn)行茶葉細(xì)胞發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)周期為20～22 d，大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)可以考慮采用槳葉式攪拌器發(fā)酵罐。茶樹愈傷組織決定著次生代謝物質(zhì)茶氨酸的合成能力，且適宜的培養(yǎng)條件可促進(jìn)茶氨酸合成。鐘俊輝等[87]研究表明，25 ℃暗培養(yǎng)、IAA+6-BA激素組合有利于茶氨酸的累積。培養(yǎng)基中的硝基態(tài)氮、適量的K+和Mg2+可以提高細(xì)胞茶氨酸合成酶的活性，有利于茶氨酸積累[88]；加入鹽酸乙胺或水解酪蛋白和酵母浸膏也可以提高愈傷組織的茶氨酸合成能力[89]；光照誘導(dǎo)苯丙烷生物合成途徑可明顯提高茶氨酸合成量[90]。

兒茶素是茶樹重要的次生代謝產(chǎn)物和重要功能物質(zhì)，具有多種藥理活性。杜鴻標(biāo)等[91]研究表明，愈傷組織中兒茶素含量與茶樹品種有關(guān)，金牡丹的兒茶素含量最高，金觀音、黃觀音、安吉白茶和楮葉齊含量次之，黃玫瑰含量最低。劉亞軍等[92]研究表明，B5培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得的愈傷組織生長(zhǎng)迅速、組織疏松、質(zhì)地均一，具有合成兒茶素的能力；同時(shí)，試驗(yàn)篩選得到兒茶素組分與鮮葉相似的細(xì)胞系云莖63Y和云莖63X。KT和IBA激素組合有利于茶愈傷組織中兒茶素的累積，在愈傷組織生長(zhǎng)周期中，兒茶素累積量與愈傷組織鮮質(zhì)量呈正相關(guān)，并在生長(zhǎng)周期變化的直線期末、靜止期初達(dá)到最高值[93]。培養(yǎng)基中添加類黃酮生物合成前體苯丙氨酸時(shí)，茶樹細(xì)胞中L-表兒茶素、D,L-兒茶素和多種兒茶素低聚體總量增加[94]；誘導(dǎo)子茉莉酮酸甲酯和酵母提取物可以促進(jìn)茶樹懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中兒茶素的積累[95]；蔗糖處理可以增加茶樹愈傷組織中兒茶素含量及組分，誘導(dǎo)茶樹細(xì)胞中兒茶素合成關(guān)鍵基因F3H、ANR表達(dá)[96]。李麗田[97]研究表明，多數(shù)兒茶素合成相關(guān)基因的表達(dá)受光強(qiáng)影響，但不同基因?qū)鈴?qiáng)的響應(yīng)模式不同，光強(qiáng)越低,受影響的兒茶素合成相關(guān)基因數(shù)目越多，基因作出響應(yīng)的時(shí)間也越早。

3 展望

茶樹組織培養(yǎng)在離體快繁、種質(zhì)資源保存和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等方面取得較大成就，發(fā)揮著重要作用。由于茶樹離體再生較為困難且轉(zhuǎn)化效率極低，今后茶樹組織培養(yǎng)研究工作中，應(yīng)加強(qiáng)激素調(diào)控機(jī)制、胚狀體發(fā)生機(jī)制等基礎(chǔ)理論研究；加強(qiáng)體細(xì)胞變異篩選和胚狀體誘導(dǎo)研究，縮短育種進(jìn)程，加快新品種培育和推廣；積極探索茶樹基因工程與組織培養(yǎng)相結(jié)合的方法和途徑，建立穩(wěn)定高效再生頻率及遺傳轉(zhuǎn)化體系，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，最終培育出更多的新、優(yōu)、特品種；深入研究細(xì)胞次生代謝途徑調(diào)控機(jī)制，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的條件，提高細(xì)胞生產(chǎn)次生代謝物的含量；加強(qiáng)對(duì)某些瀕危物種和珍貴種質(zhì)資源的離體保存，實(shí)現(xiàn)物種的多樣化。因此，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展及茶樹組織培養(yǎng)再生體系的不斷完善，茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)將在現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)揮更為重要的作用。

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Research Progresses on Culture TypesinVitroand Applications of Tea Plant

TIAN Aolei1,GAO Junjie2,LI Dandan1,YANG Xiaofang1,LIU Jianfu1*,HUANG Shousheng3,ZHANG Bin3

(1.Department of Horticulture,Huaqiao University,Xiamen 361021,China; 2.Quanzhou Municipal Bureau of Agriculture Planting Station,Quanzhou 362000,China; 3.Xianmingyan Tea Factory of Wuyishan of Fujian,Nanping 353000,China)

The culture of tea plantinvitroplays an important role in breeding,germplasm innovation,sustainable development of tea industry.This paper summarized the research progresses on culture types of axillary buds,stem-segment,seed,anther,leaf and callus of tea plantinvitro,and reviewed the application of tea plant cultureinvitroin rapid propagation,embryos induction,germplasm reserve,and secondary metabolites production.The prospects in tissue culture of tea plant were also briefly discussed,so as to provide references for the research of tea plant breeding and biotechnology.

tea plant;invitroculture; application

2016-11-09

福建省產(chǎn)業(yè)技術(shù)聯(lián)合創(chuàng)新項(xiàng)目(閩發(fā)改高技[2014]514號(hào))

田奧磊(1992-)，男，山西高平人，在讀碩士研究生，研究方向：觀賞園藝組織培養(yǎng)與種質(zhì)創(chuàng)新。E-mail:593921740@qq.com

*通訊作者：劉建福(1975-)，男，福建泉州人，副教授，博士，主要從事植物細(xì)胞工程與代謝調(diào)控研究。 E-mail:jianfu@hqu.edu.cn

S571.1

A

1004-3268(2017)05-0001-07