葡萄多倍體育種成果及影響因素概述

溫曉敏，張娜，月丫，田淑芬*

（1. 天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

葡萄多倍體育種成果及影響因素概述

溫曉敏1,2，張娜1，月丫1,2，田淑芬1*

（1. 天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

我國近20年通過審定且確定倍性的葡萄新品種中，共有5個(gè)通過雜交方法培育出的三倍體葡萄新品種，14個(gè)雜交育成的四倍體葡萄新品種，4個(gè)通過芽變選育得到的四倍體葡萄新品種，4個(gè)實(shí)生選育出的四倍體葡萄新品種，4個(gè)秋水仙素誘變而來的四倍體葡萄新品種。三倍體雜交育種和四倍體誘變育種效率較低，概述了近年來對(duì)三倍體胚挽救雜交育種和四倍體秋水仙素誘變育種影響因素的研究。綜述了育成種質(zhì)的鑒定評(píng)價(jià)方法和意義，對(duì)今后有望培育兼具大粒、無核、香味等優(yōu)良性狀的多倍體葡萄新品種進(jìn)行了展望。

多倍體；葡萄；新品種；育種方法；影響因素；種質(zhì)評(píng)價(jià)

葡萄是無性繁殖的多年生樹種，能將多倍體的優(yōu)良性狀穩(wěn)定地遺傳下去，進(jìn)而克服了多倍體育性差無法大量用于生產(chǎn)的缺點(diǎn)[1]。同時(shí)多倍體葡萄具有莖粗、節(jié)間短、果粒巨大、同化物質(zhì)含量高、種子少等優(yōu)點(diǎn)，特別是三倍體葡萄，因其大多數(shù)高度不育，所以果實(shí)無核或少核[2]。以上優(yōu)點(diǎn)使得葡萄多倍體育種研究更具意義[3]。目前育成的多倍體葡萄主要是三倍體和四倍體。本文分別對(duì)三倍體、四倍體的育種方法，近年來育種成果、影響因素及育成種質(zhì)的評(píng)價(jià)做了綜述。旨在為了解近期多倍體育種情況及多倍體育種工作提供參考。

1 葡萄多倍體育種

三倍體葡萄由于果實(shí)無核或少核，使得三倍體育種成為無核品種選育的主要途徑之一。四倍體葡萄具有果粒大、營養(yǎng)物質(zhì)含量高的優(yōu)點(diǎn)，四倍體育種是培育大粒葡萄的育種方法。三倍體與四倍體育種符合當(dāng)前大粒、無核的主要葡萄育種目標(biāo)。雜交育種是葡萄多倍體育種的常規(guī)方法[4]。育成的優(yōu)良品種約有68%為雜交方法育成的[5]。

1.1 三倍體葡萄育種

目前無核三倍體育種的主要途徑包括：二倍體與四倍體間正反交、胚乳培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、對(duì)自然突變的選擇等[3]?；ㄋ幣囵B(yǎng)和胚乳培養(yǎng)獲得多倍體成功率低，實(shí)用性差。最常用的三倍體育種方法即雜交育種。

蔣愛麗等[6-7]用二倍體“希姆勞特”分別與四倍體“藤稔”和“巨峰”雜交選育出了三倍體無核葡萄品種“滬培3號(hào)”和“滬培1號(hào)”。趙勝建等[8-10]用二倍體“鄭州早紅”和四倍體“巨峰”雜交育成了三倍體葡萄新品種“無核早紅”和“紅標(biāo)無核”，用“玫瑰香”和“巨峰”雜交育成三倍體品種“月光無核”。

1.2 四倍體葡萄育種

四倍體育種的主要方法包括有性雜交、人工誘變、對(duì)自然變異的選擇等[1]。

1.2.1四倍體雜交育種

四倍體葡萄雜交是獲得四倍體新品種的最主要途徑，己選育出許多四倍體新品種。如近年來我國審定的雜交四倍體葡萄新品種有“玫香寶”（阿登納玫瑰×巨峰）[11]、“光輝”（香悅×京亞）[12]、“申華”（京亞×優(yōu)系86-179）[13]、“申玉”（藤稔×紅后）[14]、“申豐”（京亞×紫珍香）[15]、“蜜紅”（沈陽玫瑰×黑奧林）[16]、“巨玫瑰”（沈陽大粒玫瑰香×巨峰）[17]、“黑玫香”（沈陽大粒玫瑰香×巨峰）[18]、“春光”（巨峰×早黑寶）、“蜜光”（巨峰×早黑寶）、“峰光”（巨峰×玫瑰香）、“寶光”（巨峰×早黑寶）[19]、“玉波一號(hào)”（紫地球×達(dá)米娜）、“玉波二號(hào)”（紫地球×達(dá)米娜）[20]。

1.2.2通過對(duì)自然芽變的篩選獲得葡萄四倍體新品種

二倍體葡萄自然突變產(chǎn)生多倍體的途徑分為三類[21]：合子或體細(xì)胞加倍、配子加倍和體細(xì)胞融合。此外，多倍體也可產(chǎn)生新的變異[22]。芽變屬于體細(xì)胞的變異，芽變產(chǎn)生三倍體的發(fā)現(xiàn)較少，更多的是發(fā)現(xiàn)二倍體芽變成的四倍體和四倍體變異產(chǎn)生新的四倍體。選擇四倍體的優(yōu)良芽變是改良葡萄品種的重要途徑之一。2010年以來審定的芽變品種，已鑒定其為四倍體的有：“紅地球”的芽變“紅太陽”[23]、“禮泉超紅”[24]，“巨峰”的芽變“峰早”[25]、“宇選1號(hào)”[26]。異常的環(huán)境更易誘導(dǎo)突變，自然突變是自然發(fā)生的，不受人為控制。通過自然芽變篩選培育葡萄多倍體新品種，速度緩慢，隨機(jī)性大[27]。

1.2.3通過實(shí)生選育獲得葡萄四倍體新品種

依據(jù)葡萄實(shí)生選育種間變異較大的原理[28]通過對(duì)葡萄實(shí)生播種，從中選育出性狀優(yōu)良的葡萄品種。近年來從“巨峰”實(shí)生系中選育出了四倍體葡萄新品種“申寶”[29]、“貴園”[30]、“峰后”[31]；用“甲裴露”實(shí)生播種選育出了四倍體葡萄新品種“紅十月”[28]。通過播種進(jìn)行有性繁殖，利用葡萄種子間可能的變異，可增加多倍體新品種產(chǎn)生可能性。

1.2.4人工誘變培育葡萄四倍體新品種

多倍體不僅可以自然發(fā)生，也可以通過人工誘變，人工誘導(dǎo)植物多倍體的方法分為物理法和化學(xué)法。

物理方法主要有切傷、摘心、嫁接、改變溫度。反復(fù)切傷和摘心會(huì)產(chǎn)生多倍體的原因在于反復(fù)切傷、摘心刺激細(xì)胞分裂，細(xì)胞核分裂速度較細(xì)胞分裂速度快，于是在細(xì)胞內(nèi)形成雙核或多核，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體；同理嫁接時(shí)在愈合處也易形成染色體加倍枝條；改變溫度形成多倍體的原因在于當(dāng)溫度過高或過低會(huì)阻礙細(xì)胞正常分裂[27]。除此之外還包括X射線、離心力等物理誘變方法，但效率較低。物理法誘變的葡萄新品種較少，近幾年育成的葡萄新品種，如：“瑞都紅玉”葡萄為“瑞都香玉”(京秀×香妃)高接時(shí)發(fā)生的紅色芽變[32]。

化學(xué)方法主要用秋水仙素處理植物分裂旺盛部位，是人工誘導(dǎo)植物多倍體的最有效方法[33]。秋水仙素可以抑制有絲分裂前期紡錘體的形成，無法牽引染色體均分到細(xì)胞兩極而使染色體加倍。石雪暉等[34]以萌發(fā)的刺葡萄種子為試材，用秋水仙素化學(xué)誘導(dǎo)選育出了刺葡萄四倍體新品種“湘釀1號(hào)”。常將雜交育種與誘變育種相結(jié)合，進(jìn)行葡萄新品種選育，如“瑰寶”與“秋紅”雜交后經(jīng)秋水仙素誘變選育出四倍體新品種“晚紅寶”[25]、“秋黑寶”[35]；以“瑰寶”與“早玫瑰”的雜交種子用秋水仙素誘變育成的四倍體葡萄新品種“早黑寶”[36]。還可用異生長(zhǎng)素等對(duì)植物進(jìn)行誘變，但效率極低，成功率一般小于5%[27]。

2 葡萄多倍體育種影響因素

目前我國育成多倍體葡萄品種多為四倍體，三倍體育種效率不高。有必要對(duì)其育種方法及影響因素進(jìn)行總結(jié)，為多倍體育種效率的提高提供參考。

2.1 三倍體雜交育種影響因素

雜交培育三倍體，由于不同倍性間雜交障礙，胚敗育嚴(yán)重，因此需要通過胚挽救技術(shù)在胚敗育之前進(jìn)行離體胚挽救，從而提高雜交后代獲得率。胚挽救雜交育種的一般流程為：花粉采集→去雄授粉→取樣消毒并剝?nèi)∨咧椤咧榕囵B(yǎng)（胚發(fā)育）→剝胚→胚萌發(fā)培養(yǎng)→胚成苗培養(yǎng)→繼代培養(yǎng)→煉苗移栽[37-38]。

為提高胚挽救成功率，需對(duì)胚挽救各階段影響因素進(jìn)行優(yōu)化。雜交組合的選擇，取樣時(shí)間，培養(yǎng)基種類，光、溫等培養(yǎng)條件，胚萌發(fā)培養(yǎng)時(shí)間，胚珠處理方式等對(duì)胚挽救效果影響重大。徐海英[39]證明了胚挽救是克服胚敗育的有效途徑。普遍認(rèn)為不同雜交組合最佳取樣期不同，且與母本成熟期密切相關(guān)[39-41]。關(guān)于胚發(fā)育培養(yǎng)，唐冬梅[41]認(rèn)為固液雙相Nitsch＋GA30.5 mg/L＋I(xiàn)AA 1.5 mg/L和MM3培養(yǎng)基最適宜于無核葡萄離體幼胚的發(fā)育，低溫會(huì)降低胚發(fā)育率；暗培養(yǎng)有利于幼胚的發(fā)育。而郭印山等[42]認(rèn)為二倍體與四倍體雜交胚在無機(jī)鹽濃度較低的White培養(yǎng)基上更有利于胚發(fā)育。王素月[40]研究表明在1/2MS＋I(xiàn)AA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上有利于胚萌發(fā)；剝?nèi)÷闩呙劝l(fā)快，且成苗率高。

2.2 四倍體秋水仙素誘變育種影響因素

用秋水仙素誘導(dǎo)葡萄多倍體時(shí)，影響誘變率的因素有處理材料的生長(zhǎng)狀態(tài)、秋水仙素濃度和處理時(shí)間[4]。羅耀武等[43]用0.2%秋水仙素溶液處理“玫瑰香”葡萄植株的生長(zhǎng)點(diǎn)45 h，獲得了四倍體“玫瑰香”。張丙秀等[44]探索了秋水仙素濃度及不同處理方法對(duì)“京秀”葡萄變異的影響，研究表明對(duì)于浸泡單芽莖段法，濃度的影響強(qiáng)于處理時(shí)間，最佳誘導(dǎo)濃度及時(shí)間為 0.3%處理 24 h；而對(duì)于混培法，處理時(shí)間的影響卻強(qiáng)于濃度，最佳誘導(dǎo)濃度及時(shí)間為2000 mg/L處理 30 d。在離體誘變研究，張淑愛等[45]在0.1%秋水仙素溶液中浸泡葡萄試管苗莖段6 h，再扦插在不含秋水仙素的B5培養(yǎng)基中，獲得根尖加倍的四倍體“里扎馬特”和長(zhǎng)?！盁o核白”。盧炳芝等[46]用“勝利”葡萄品種帶花藥的花絲誘導(dǎo)胚狀體,然后用0.2%秋水仙素浸泡胚狀體5 d，獲得同質(zhì)變異的四倍體。這些方法需經(jīng)組織培養(yǎng)，對(duì)于有核的葡萄品種，以種子為材料誘導(dǎo)加倍，可直接得到加倍植株。

陳俊[47]采用種子浸漬法處理“瑰寶”葡萄天然授粉種子，待催芽4 d后胚莖伸長(zhǎng)1 cm左右時(shí)，分別用0.2%和0.4%的秋水仙素溶液處理,均獲得了同質(zhì)四倍體。閆愛玲等[48]研究表明當(dāng)未名玫瑰種子胚根長(zhǎng)1.0 cm時(shí)，用0.5%秋水仙素處理96 h，其成活率和四倍體率較高分別為11.33%和5.12%。

3 育成葡萄種質(zhì)鑒定評(píng)價(jià)

育種后首先應(yīng)進(jìn)行早期倍性鑒定，以提高育種效率。定植田間后應(yīng)調(diào)查性狀，以便篩選優(yōu)良種質(zhì)進(jìn)一步擴(kuò)繁、純化、審定、推廣，以及進(jìn)一步用于新品種的培育。

3.1 倍性鑒定

倍性鑒定最準(zhǔn)確常用的方法為染色體計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞儀倍性分析法，其他如：減數(shù)分裂觀察法、形態(tài)學(xué)鑒定法、解剖學(xué)鑒定法、生理生化指標(biāo)鑒定法、同工酶電泳譜帶的特征法等可作為輔助鑒定方法。

3.1.1染色體計(jì)數(shù)法

倍性鑒定最直接的方法就是染色體計(jì)數(shù)法。染色體計(jì)數(shù)法以根尖、幼芽、幼葉、莖尖、卷須為材料[49]，根據(jù)材料不同各步驟略有不同。王小利[50]發(fā)現(xiàn)以葡萄根尖為試材，壓片成功率最高。錢春[51]在白香蕉葡萄芽變突變體鑒定中，首先采用根尖做試驗(yàn)材料進(jìn)行初步鑒定，然后對(duì)卷須進(jìn)行連續(xù)鑒定，避免了只是根部加倍而地上部不加倍的現(xiàn)象。

染色體計(jì)數(shù)法包括常規(guī)壓片法和去壁低滲法[52]。常規(guī)壓片法需掌握好酸解時(shí)間，去壁低滲法需控制好低滲處理和酶解時(shí)間。對(duì)于儲(chǔ)藏物質(zhì)多的幼芽、幼葉、莖尖、卷須宜采用去壁低滲法，對(duì)于根尖采用常規(guī)壓片法較簡(jiǎn)便[53]。郭印山[37]用常規(guī)壓片法對(duì)根尖進(jìn)行了染色體倍性鑒定。常金華[54]運(yùn)用去壁低滲法對(duì)人工誘變的四倍體“玫瑰香”葡萄卷須的染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)，來確定倍性。孫馬[55]用去壁低滲染色體計(jì)數(shù)法對(duì)部分中國野生葡萄的幼葉和幼芽進(jìn)行了倍性鑒定。

3.1.2流式細(xì)胞儀倍性分析

對(duì)于染色體數(shù)目較多的材料，染色體計(jì)數(shù)法鑒定較困難?？衫昧魇郊?xì)胞光度術(shù)（FCM）測(cè)定細(xì)胞核DNA含量鑒定材料倍性[56-60]。流式細(xì)胞儀的問世為植物染色體倍性的研究提供了一條便捷的途徑，其鑒定快速方便，且準(zhǔn)確性較高[60]。郭印山[37]、張丙秀[44]、趙艷華[60]等利用流式細(xì)胞儀分別對(duì)葡萄進(jìn)行了倍性鑒定。

3.2 性狀調(diào)查

3.2.1物候期調(diào)查

調(diào)查物候期為評(píng)價(jià)葡萄經(jīng)濟(jì)性狀提供了依據(jù)，為葡萄新品種的引種栽培管理提供參考。一般調(diào)查葡萄萌芽始期、開花始期、開花盛期、漿果開始生長(zhǎng)期、漿果始熟期、漿果完熟期、新梢開始成熟期等。三倍體葡萄“無核早紅”[8]、“紅標(biāo)無核”[9]為極早熟品種，四倍體“紅十月”[28]為極晚熟品種。其他：“玫香寶”[11]、“光輝”[12]、“申華”[13]、“貴園”[30]、“宇選1號(hào)”[26]、“峰早”[25]、“早黑寶”[36]為早熟品種；“滬培1號(hào)”[7]、“黑玫香”[18]、“申豐”[15]、“巨玫瑰”[17]、“蜜光”[19]為中早熟品種；“滬培3號(hào)”[6]、“峰光”、“寶光”[19]、“申寶”[29]、“秋黑寶”[35]為中熟品種；“玉波一號(hào)”、“玉波二號(hào)”[20]、“申玉”[14]、“峰后”[31]為中晚熟品種；“禮泉超紅”[24]、“蜜紅”[16]、“紅太陽”[23]、“晚紅寶”[25]為晚熟葡萄品種。許多多倍體表現(xiàn)出成熟期提前的特點(diǎn)，不同成熟期的葡萄品種極大的延長(zhǎng)了葡萄的市場(chǎng)供應(yīng)，同一成熟期葡萄品種的豐富可滿足消費(fèi)者多樣化的需求。

3.2.2植物學(xué)特性調(diào)查

調(diào)查嫩梢、新梢、幼葉、成齡葉、成熟枝條的各項(xiàng)植物學(xué)特征，為種質(zhì)的區(qū)別、鑒定提供依據(jù)。多倍體葡萄品種較二倍體葡萄多表現(xiàn)為莖粗、節(jié)間短、葉片大且厚，葉色濃綠，雌蕊柱頭高等特點(diǎn)[1]。

3.2.3生長(zhǎng)結(jié)果習(xí)性

調(diào)查植株生長(zhǎng)勢(shì)、萌芽率、副芽萌發(fā)力、隱芽萌發(fā)力、每結(jié)果枝果穗數(shù)、結(jié)果枝百分率、產(chǎn)量、坐果率等，對(duì)種質(zhì)生產(chǎn)力做評(píng)價(jià)。經(jīng)比較多倍體葡萄普遍較二倍體葡萄生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、產(chǎn)量高，四倍體葡萄每穗花和果粒數(shù)較二倍體少。

3.2.4果實(shí)經(jīng)濟(jì)性狀

調(diào)查果穗的形狀、有無歧肩、有無副穗、大小、重量、緊密度，果粒的形狀、重量、大小，顏色、香味、脆度、營養(yǎng)含量、含種子數(shù)等。以對(duì)果實(shí)的品質(zhì)做評(píng)價(jià)。其中四倍體葡萄果粒大，三倍體葡萄果實(shí)無核或少核，且多倍體葡萄營養(yǎng)物質(zhì)含量較二倍體高。近年來育成的玫瑰香型葡萄品種有：“玉波一號(hào)”、“玉波二號(hào)”[20]、“早黑寶”[36]、“巨玫瑰”[17]、“晚紅寶”[25]、“秋黑寶”[35]、“黑玫香”[18]，草莓香型葡萄品種有：“月光無核”[10]、“申豐”[15]、“貴園”[30]、“峰后”[31]，具玫瑰香和草莓香的品種：“玫香寶”[11]以及具蜂蜜清香味的葡萄品種“蜜紅”[16]。以玫瑰香味為代表的香味葡萄深受消費(fèi)者喜愛，選育香味葡萄是當(dāng)前育種的又一新趨勢(shì)。

3.2.5抗性

調(diào)查新品種的抗寒、抗旱、抗病蟲害性，為栽培管理提供借鑒。多倍體葡萄普遍體現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，“滬培3號(hào)”[6]、“滬培1號(hào)”[7]、“無核早紅”[8]、“紅標(biāo)無核”[9]、“春光”[19]、“禮泉超紅”[24]、“峰后”[31]等抗病性均較強(qiáng)，此外“玫香寶”[11]還具有較強(qiáng)的抗寒性，“月光無核”[10]抗旱性強(qiáng)。

4 存在的問題及展望

4.1 多倍體育種

目前，已培育出一大批四倍體優(yōu)良新品種，不僅生產(chǎn)上得到了大面積的推廣，同時(shí)又作為進(jìn)一步培育新品種的育種材料。如秋黑葡萄單株芽變得到大粒、淡玫瑰香味的“紫地球”[61]與比坎、玫瑰香雜交育成具濃郁玫瑰香味的“達(dá)米娜”[62]雜交育成大粒，具濃郁玫瑰香味葡萄新品種“玉波一號(hào)”、“玉波二號(hào)”[20]。但葡萄三倍體育種育成品種少，二倍體與四倍體雜交胚挽救技術(shù)還有待進(jìn)一步優(yōu)化[63]。在對(duì)雜交后代胚挽救時(shí)，不同雜交組合選擇培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基種類、激素種類及濃度等都需要進(jìn)一步實(shí)踐與摸索[38]。葡萄胚挽救試驗(yàn)中采用的胚發(fā)育培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短不一，我們研究發(fā)現(xiàn)各雜交組合胚發(fā)育培養(yǎng)在65～95 d成苗效果較好。具香味、果肉脆甜、無核、大粒是消費(fèi)者喜愛的葡萄性狀，可選擇無核果肉脆甜葡萄與大粒濃香型葡萄雜交，通過胚挽救技術(shù)，還可結(jié)合誘變育種技術(shù)，培育優(yōu)良性狀于一身葡萄多倍體新品種。此外，隨著基因工程的發(fā)展和葡萄抗病、無核基因的闡明，有望實(shí)現(xiàn)基因工程在葡萄育種中的應(yīng)用，高效培育目的性狀的葡萄新品種。

4.2 種質(zhì)評(píng)價(jià)

對(duì)種質(zhì)的全面評(píng)價(jià)是其栽培管理、市場(chǎng)前景評(píng)估的重要依據(jù)。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細(xì)胞技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多倍體葡萄的早期、快速、大批量鑒定，從而提高育種效率[1]。許多育成葡萄新品種，由于未做倍性鑒定，不能確定其倍性，這大大局限了對(duì)葡萄新品種的開發(fā)利用。

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10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.026

2017-06-09

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（16ZXZYNC00160），天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)基金（15010）。

溫曉敏（1991-）,女，山西晉中人，在讀碩士生，主要從事葡萄胚挽救育種研究。E-mail: 837760363@qq.com

*通訊作者：田淑芬（1966-），女，研究員，博士，主要從事葡萄栽培與選育種方面的研究。E-mail: tianshufen@263.net