馬齒莧黃酮提取工藝及其分離純化和抑菌作用分析

●鄭楚萍陳法江陶濤

馬齒莧黃酮提取工藝及其分離純化和抑菌作用分析

●鄭楚萍1陳法江2陶濤3

目的：探究馬齒莧黃酮提取工藝的條件及對其抑菌作用的研究。方法：馬齒莧黃酮提取的過程大致為：首先采用超聲波法粗提馬齒莧黃酮液，再采用正交試驗對粗提液進行優(yōu)化，最后經(jīng)大孔吸附樹脂對優(yōu)化液進行純化，再通過紙片擴散法對純化后的黃酮進行抑菌試驗。結果：我們研究得出在料液比為1:25、溫度50℃、時間40m in、功率200W是馬齒莧黃酮最佳的提取條件，在此條件下，黃酮的得率為3.6%。抑制強弱順序為：酵母菌＞黑曲霉＞醋酸菌＞大腸桿菌。

馬齒莧；黃酮；提取與純化；抑菌活性

馬齒莧使用常見的中草藥，也是大眾喜歡的野生蔬菜，隨著對馬齒莧的不斷深入了解，馬齒莧已經(jīng)公認的為“藥食同源”的植物，所以無論從保健上還是從食用上來看，馬齒莧都是一種不可多得的藥品及食物。根據(jù)有關文獻表明馬齒莧對痢疾桿菌具有殺菌作用，其煎服對大腸桿菌也有一定的療效，其提取液對某些真菌也具有一定的抑制效果，而本文的主要分析是對其提取、純化馬齒莧黃酮的工藝條件并對其抑菌作用進行初步研究?，F(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 馬齒莧

在廣州某藥店購買；大孔吸附樹脂：由東鴻化工有限公司提供；其他試劑均由廣州醫(yī)科大學農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏實驗室提供。

1.2 馬齒莧中黃酮的提取和測定

取適量馬齒莧物品，放于圓底燒瓶中，并去除其中夾雜的脂肪雜質，然后將抽提液冷卻過濾，將上層液體棄去，放置于低溫干燥箱中烘干，備用。黃酮的含量通過比色法測定[1]，溶液的吸光值用分光光度計在510nm處測定。

1.3 馬齒莧黃酮提取單因素試驗和正交試驗

對乙醇體積分數(shù)、料液比、溫度、時間和超聲功率進行單因素試驗。在單因素試驗的基礎上，確定正交試驗的工藝參數(shù)，選擇四因素三水平進行正交試驗，經(jīng)方差分析確定馬齒莧黃酮提取的最佳工藝條件。

1.4 馬齒莧中提取液的純化

將濃度為0.5g/m L的黃酮提取液上層放在預先處理好的大孔樹脂(pH為中性)層析柱中，控制流速為0.5m L/m in，達到飽和后用70%的乙醇作為洗脫劑以2m L/min的流速進行洗脫，自動收集器收集洗脫液。

1.5 黃酮的抑菌活性

黃酮的抑菌活性的測定采用紙片擴散分析方法。大腸桿菌、醋酸菌、酵母菌和黑曲霉用作指示細菌并接種于平板上。無菌濾紙片于黃酮溶液(5mg/m L)中浸濕，取出，置于平板上。以生理鹽水作為對照。培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，對抑菌區(qū)進行觀察測定。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS21.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，其中計數(shù)資料采用卡方驗，計量資料采用t檢驗，當P＜0.05為差異顯著有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 超聲波輔助法馬齒莧黃酮的單因素分析

（1）乙醇濃度對馬齒莧提取的影響：在本次研究中采用的為70%的無水乙醇為溶劑，在溫度、時間等條件不變情況在分別采用不同濃度的乙醇后，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加馬齒莧提取效果呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢，提取效果在乙醇濃度為70%附近效果最好。（2）溫度對馬齒莧提取的影響：當固定其他條件，而溫度作為變量時發(fā)現(xiàn)，在不同的溫度下，開始隨著的溫度的升高馬齒莧的提取液效果也升高，在大約60℃左右時隨著溫度的升高，提取濃度將不再變化。（3）提取時間對馬齒莧提取效果的影響：固定其他條件，將提取時間作為變量時發(fā)現(xiàn)，同乙醇濃度對馬齒莧的影響相同，隨著時間的變化，呈單峰形式，在大約40m in左右時達到峰值。（4）料液比對馬齒莧黃酮提取的影響：料液比對馬齒莧提取的影響與溫度的影響大致相同，在1:25處提取達到最佳狀態(tài)。（5）功率的影響：固定其他條件，而功率作為變量時，功率對馬齒莧黃酮提取的影響也是一個單峰改變，并且在200W處為最佳提取功率。

2.2 正交實驗

選取料液比、溫度、時間、功率進行四因素三水平的正交試驗，確定最佳條件，最終發(fā)現(xiàn)四個因素中對馬齒莧黃酮體影響最大的因素就是功率，并且在料液比1:25，溫度50℃、40m in、200W處提取的效果最佳。

2.3 提純

提取的粗黃酮經(jīng)干燥后，使用大孔吸附樹脂進一步純化，得出采用70%的無水乙醇將黃酮洗出來后在采用蒸餾水洗，洗出來的曲線呈單一峰。

2.4 抑菌結果的對比

馬齒莧分別對酵母菌、黑曲霉、醋酸菌、大腸桿菌進行體外實驗，發(fā)現(xiàn)馬齒莧對酵母菌抑菌較大、其次為黑曲霉、最后為大腸桿菌。

3 討論

大量研究表明，馬齒莧具有各種生物學效應，主要包括骨骼肌松弛作用，鎮(zhèn)痛和抗炎性作用，抗真菌活性和抗生育作用。黃酮是一大類化合物的總稱，經(jīng)過研究其具有豐富的生物和藥理活性，如能夠抗細菌、抗真菌、抗螨蟲、抗高血壓活性、消炎和抗病毒，隨著對黃酮結構深入的研究，這類天然產(chǎn)物正逐漸地成為抗菌研究的主題。馬齒莧黃酮研究的熱點引起了化學家和免疫生物學家的重視，尤其是對免疫調節(jié)和抗病毒特性。同時，它們的抗菌活性也值得進一步研究。

在本次研究中發(fā)現(xiàn)對馬齒莧黃酮提取最有利的條件為1:25、溫度50℃、時間40min、功率200W是馬齒莧黃酮最佳的提取條件。在此條件下，黃酮的得率為3.61%，在孫希云[2]的報道中采用無水乙醇對馬齒莧進行分離純化，最終得到的濃度為3.52%，這與本文的結論大致相同，但是張?zhí)亓3]采用與孫希云相同的條件、過程提取的黃酮僅為0.63%，這種顯著性差異是可能是由于馬齒莧的不通過引起的。在本次研究中的抑菌強弱順序為：酵母菌＞黑曲霉＞醋酸菌＞大腸桿菌。結果對馬齒莧黃酮的綜合利用和抑菌機制的研究都具有重要意義?；谶@些結果，可以看出馬齒莧黃酮在食物腐敗、食物中毒的預防和治療方面能夠發(fā)揮顯著的作用。

（作者單位：1廣州醫(yī)科大學藥學院；2廣州醫(yī)科大學研究生院；3廣州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院）

[1]王英豪,魏國強,張理平.馬齒莧黃酮含量測定方法的建立[J].福建中醫(yī)藥大學學報,2012,22(2):44-46.

[2]孫希云,牛廣財,孟憲軍,等.馬齒莧中黃酮類化合物的最佳提取工藝.食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(11):135-137.

[3]張?zhí)亓?于春月.馬齒莧中總黃酮的提取工藝研究.黑龍家醫(yī)藥科學,2013,36(4):37-38.

鄭楚萍（1990～），女，碩士研究生，實驗師，研究方向為藥物化學研究。