真菌毒素免疫檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

□ 王文珺 桑華春 北京智云達(dá)科技股份有限公司

真菌毒素免疫檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

□ 王文珺 桑華春 北京智云達(dá)科技股份有限公司

真菌毒素，又稱霉菌毒素，是指霉菌在其所污染的食品中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，可通過進(jìn)食進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)，引起人或動(dòng)物的急性或慢性中毒，進(jìn)而損害機(jī)體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織等。

真菌毒素的特性及起源

真菌毒素，又稱霉菌毒素，是指霉菌在其所污染食品中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，可通過進(jìn)食進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)，引起人或動(dòng)物的急性或慢性中毒，進(jìn)而損害機(jī)體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織等。致癌性是真菌毒素對(duì)機(jī)體最嚴(yán)重和最普遍的危害。真菌毒素可在農(nóng)作物生長(zhǎng)或收獲時(shí)形成，也會(huì)因貯存條件的不適宜而產(chǎn)生。濕度或溫度高的環(huán)境通常有利于糧食和飼料中霉菌的生長(zhǎng)及其毒素的產(chǎn)生。真菌毒素最早于1960年被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)英國(guó)有10萬只火雞死于該種疾病，后來鴨子也被波及?？茖W(xué)家很快在花生餅飼料中發(fā)現(xiàn)了“罪魁禍?zhǔn)住保阂环N真菌產(chǎn)生的毒素，隨后被命名為“Aflatoxin”。從此以后，科學(xué)家投入了大量的時(shí)間和精力研究真菌毒素，并發(fā)現(xiàn)其主要包括以下幾個(gè)特點(diǎn)：

①低分子化合物：真菌毒素都是分子量小于1000的小分子化合物；

②對(duì)溫度非常穩(wěn)定，即使加熱到340℃也不會(huì)被分解和破壞；

③抗化學(xué)生物制劑及物理的滅活作用；

④具有廣泛的中毒效應(yīng)；

⑤結(jié)構(gòu)特異性：分子結(jié)構(gòu)不同，毒性差異很大。例如黃曲霉毒素B1是毒性最強(qiáng)的真菌毒素，比砒霜毒性還強(qiáng)，但是僅改變其分子結(jié)構(gòu)中的一個(gè)化學(xué)鍵，它的毒性就會(huì)顯著下降。其實(shí)還有一個(gè)特點(diǎn)需要特別強(qiáng)調(diào)，就是真菌毒素在樣品中的分布是不均勻的，因此分析過程中的取樣方式和取樣量非常重要，往往能夠決定結(jié)果誤差的范圍。

目前，己確定的真菌毒素有400多種，常見毒素包括：黃曲霉毒素（AF，包括B1、B2、M1、M2）、玉米赤霉烯酮/醇（ZEN）、赭曲毒素（OTA）、T2毒素、嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，DON）、伏馬毒素（FM，包括B1、B2、B3）等。其中黃曲霉毒素B1被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的真菌毒素，也是糧食和飼料監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)。

真菌毒素的危害

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，每年全世界大約有25%的農(nóng)產(chǎn)品受到真菌毒素污染，其中約2%因污染失去價(jià)值，引起的損失達(dá)千億美元。飼料及原料（糧食）中的真菌毒素污染對(duì)畜牧業(yè)影響巨大，美國(guó)因真菌毒素造成的損失達(dá)到14.4億美元/年，我國(guó)損失則更大，達(dá)到150億美元/年。由真菌毒素污染導(dǎo)致的食品質(zhì)量安全問題已經(jīng)引發(fā)社會(huì)的廣泛關(guān)注，真菌毒素是導(dǎo)致糧食和飼料污染的重要原因，如果動(dòng)物食用了被真菌毒素污染的飼料，也可能造成動(dòng)物源性食品的污染。例如，奶牛吃了被黃曲霉毒素B1污染的飼料，它所產(chǎn)的牛奶中就會(huì)含有黃曲霉毒素M1。不僅如此，被黃曲霉毒素污染的飼料還會(huì)影響食用動(dòng)物的健康。仍以奶牛為例，真菌毒素通過改變機(jī)體的新陳代謝和行為，導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量降低，因飼喂受真菌毒素污染的飼料而造成產(chǎn)奶量減少是奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的常見現(xiàn)象。對(duì)奶牛產(chǎn)奶造成不利影響的真菌毒素主要是黃曲霉毒素和不同種類的鐮刀菌毒素。黃曲霉毒素?fù)p害奶牛的肝臟組織，破壞肝臟功能，嚴(yán)重情況下會(huì)導(dǎo)致奶牛死亡。除此之外，黃曲霉毒素對(duì)豬的胚胎致死率高，致畸性強(qiáng)，易導(dǎo)致胚胎早期死亡被吸收、流產(chǎn)、弱仔，從而降低繁殖率。

概括來說，真菌毒素的危害性主要具有以下特點(diǎn)：其一為普遍性，即在谷物生產(chǎn)、儲(chǔ)藏、加工階段已經(jīng)被感染，尤以玉米更為嚴(yán)重。二是隱蔽性—感官難以判斷，除非已經(jīng)發(fā)生顏色、氣味等變化，隱蔽性毒素?zé)o法用常規(guī)物理方法判斷。第三為微量性：低劑量即可導(dǎo)致畜禽或人患病。第四，蓄積性：一些真菌毒素如玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素等不易排出體外，會(huì)在體內(nèi)蓄積達(dá)到中毒劑量。最后是協(xié)同性，表現(xiàn)為混合污染，協(xié)同作用，加大對(duì)人類、畜禽機(jī)體和生產(chǎn)性能的危害。

為了消除真菌毒素的危害，目前人們主要從兩個(gè)方面著手：一是建立準(zhǔn)確、快速、靈敏、多目標(biāo)物的檢測(cè)技術(shù)；二是研究發(fā)現(xiàn)真菌毒素的脫毒技術(shù)的研究。

國(guó)內(nèi)市場(chǎng)真菌毒素快檢產(chǎn)品現(xiàn)狀

從“十五”起，食品質(zhì)量安全問題就已引起了國(guó)家政府的高度重視，政府的重要工作會(huì)議都強(qiáng)調(diào)了食品質(zhì)量安全的重要性。2015年10月1日實(shí)施的新《食品安全法》，加大了對(duì)食品質(zhì)量安全的監(jiān)管力度和懲治力度。同時(shí)，新《食品安全法》第一百一十二條規(guī)定：縣級(jí)以上人民政府食品藥品監(jiān)督管理部門在食品安全監(jiān)督管理工作中可以采用國(guó)家規(guī)定的快速檢測(cè)方法對(duì)食品進(jìn)行抽查檢測(cè)。對(duì)抽查檢測(cè)結(jié)果表明可能不符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)的食品，應(yīng)當(dāng)依照本法第八十七條的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)。抽查檢測(cè)結(jié)果確定有關(guān)食品不符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)的，可以作為行政處罰的依據(jù)。以上，從法律層面肯定了快檢可以作為一種執(zhí)法手段，這也就對(duì)快檢技術(shù)及產(chǎn)品提出了更高的要求。

經(jīng)過我國(guó)政府十余年的努力，國(guó)產(chǎn)食品中的化學(xué)污染和殘留已經(jīng)得到有效控制，但是真菌毒素污染問題仍較為突出。真菌毒素對(duì)糧食、飼料、奶、肉、蔬菜、水果的危害已經(jīng)到達(dá)令人觸目驚心的程度，對(duì)真菌毒素的監(jiān)測(cè)也已經(jīng)引起國(guó)家相關(guān)部門的充分重視。在國(guó)家糧食局、農(nóng)業(yè)部、國(guó)家食藥總局等部門的監(jiān)控計(jì)劃中，都把食品中真菌毒素列為監(jiān)測(cè)重點(diǎn)。2017年3月17日，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素的限量》（GB 2761-2017）替代了GB 2761-2011?？萍疾俊笆濉眹?guó)家科技支撐項(xiàng)目也把真菌毒素檢測(cè)及脫毒技術(shù)列為資助重點(diǎn)，為控制真菌毒素的社會(huì)危害提供技術(shù)保障。

目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)真菌毒素的免疫快檢方法主要包括膠體金檢測(cè)卡、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒和時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)卡等，相關(guān)的快檢儀器設(shè)備有酶標(biāo)儀、膠體金讀卡儀和時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀。此外，還包括一些前處理方法和設(shè)備，如凈化柱、免疫親和柱等。國(guó)內(nèi)有上百家食品安全快檢公司能生產(chǎn)檢測(cè)真菌毒素的快檢產(chǎn)品，但產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，高質(zhì)量的產(chǎn)品相對(duì)較少，造成的現(xiàn)實(shí)情況是真菌毒素快檢產(chǎn)品在我國(guó)市場(chǎng)還無法完全實(shí)現(xiàn)本土化。一些權(quán)威檢測(cè)和監(jiān)管部門依然比較認(rèn)同美國(guó)羅馬（Romer）公司和Charm公司的產(chǎn)品。一個(gè)普遍的觀點(diǎn)是，雖然國(guó)外產(chǎn)品價(jià)格比國(guó)內(nèi)產(chǎn)品高50%甚至100%，但是其產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高。事實(shí)上，國(guó)內(nèi)自主研發(fā)的產(chǎn)品在質(zhì)量上已經(jīng)有所突破，在一些官方組織的產(chǎn)品比對(duì)實(shí)驗(yàn)中，甚至出現(xiàn)國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量超過國(guó)外產(chǎn)品的情況，這可以說是國(guó)內(nèi)真菌毒素快檢行業(yè)的一大進(jìn)步。但大的技術(shù)方向還是步國(guó)外技術(shù)的后塵，依然是模仿+超越的模式。其實(shí)從樣本適用性和價(jià)格的角度講，國(guó)內(nèi)產(chǎn)品應(yīng)該具有明顯的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。這就需要國(guó)內(nèi)的企業(yè)在質(zhì)量上把關(guān)，提高核心技術(shù)優(yōu)勢(shì)，對(duì)真菌毒素的性質(zhì)、危害及在糧食及飼料中的代謝動(dòng)力學(xué)有充分了解，提早在產(chǎn)品研發(fā)上攻關(guān)，盡早完成市場(chǎng)培育，推動(dòng)企業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力，實(shí)現(xiàn)我國(guó)自主研發(fā)的產(chǎn)品對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的覆蓋，從而保障我國(guó)人民群眾的生命財(cái)產(chǎn)安全，實(shí)現(xiàn)對(duì)糧食、飼料、奶、肉及水果、蔬菜的有效監(jiān)管，

目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)真菌毒素的免疫快檢方法主要包括膠體金檢測(cè)卡、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒和時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)卡等，相關(guān)的快檢儀器設(shè)備有酶標(biāo)儀、膠體金讀卡儀和時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀。

目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)真菌毒素快檢產(chǎn)品的研發(fā)重點(diǎn)和難點(diǎn)問題主要集中在原材料的質(zhì)量、產(chǎn)品的適用性、產(chǎn)品的性能、重點(diǎn)監(jiān)測(cè)物這 4 個(gè)方面。維護(hù)我國(guó)對(duì)外貿(mào)易活動(dòng)的正常進(jìn)行。

真菌毒素免疫檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)

技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)

目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)真菌毒素快檢產(chǎn)品主要是基于抗原、抗體（不排除使用受體和配體）特異性反應(yīng)的免疫快檢產(chǎn)品。產(chǎn)品研發(fā)中的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題主要集中在原材料的質(zhì)量、產(chǎn)品的適用性、產(chǎn)品的性能、重點(diǎn)監(jiān)測(cè)物這4個(gè)方面。

第一，抗原、抗體等原材料的質(zhì)量。要了解原材料的重要性，需先了解抗體制備流程。真菌毒素屬于小分子物質(zhì)（分子量＜1000），其本身不具有免疫原性，需要與大蛋白偶聯(lián)才能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。如何將小分子的物質(zhì)轉(zhuǎn)變成免疫原？首先需要合成一個(gè)帶有活性基團(tuán)（一般是-COOH和-NH2）的碳鏈長(zhǎng)臂，即半抗原。半抗原位點(diǎn)的選擇與抗體的特異性關(guān)系極大，其與大的蛋白結(jié)合（比如牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA等）可獲得免疫原和包被原。用免疫原免疫動(dòng)物待效價(jià)和特異性達(dá)到要求，取動(dòng)物抗血清獲得多克隆抗體，如果不采血而是進(jìn)一步取動(dòng)物脾臟細(xì)胞、融合、克隆、培養(yǎng)上清和打腹水等步驟，將獲得單克隆抗體。免疫動(dòng)物的類型和免疫方法與抗體的親和力關(guān)系較大，抗體的親和性是抗體質(zhì)量的一個(gè)重要參數(shù)。本項(xiàng)目研究中包括但不限于以下3點(diǎn)要特別關(guān)注—半抗原偶聯(lián)的位點(diǎn)、免疫方式、單抗制備過程中的克隆和篩選。

在真菌毒素抗體制備方面，國(guó)內(nèi)一些高校、科研機(jī)構(gòu)及規(guī)模較大的食品安全檢測(cè)試劑公司都在開展相關(guān)工作，其中不乏一些高特異性（或廣譜性）、高親和性的抗體。而且一些技術(shù)申請(qǐng)了國(guó)內(nèi)專利，甚至有些科研機(jī)構(gòu)抗體的制備方法還申請(qǐng)了國(guó)外專利，并把抗體賣到了國(guó)外多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。好的原料來源是優(yōu)質(zhì)快檢產(chǎn)品的充分必要條件，而高質(zhì)量、穩(wěn)定來源的抗原抗體是目前快檢產(chǎn)品研發(fā)公司面臨的最主要問題之一?？贵w的特異性與匹配的抗原關(guān)系極大，穩(wěn)定的抗原制備流程也是必須關(guān)注的重點(diǎn)。

第二，快檢產(chǎn)品的適用性。國(guó)內(nèi)真菌毒素快檢產(chǎn)品沒有覆蓋國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的原因是產(chǎn)品質(zhì)量不能完全滿足檢測(cè)要求，或者說國(guó)外的產(chǎn)品能更好地滿足檢測(cè)要求（準(zhǔn)確性、便捷性）。比如Charm的膠體金檢測(cè)卡，一條C線，兩條T線，能夠通過讀卡儀實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。而國(guó)內(nèi)膠體金檢查卡，基本以定性檢測(cè)為主，只有極少數(shù)廠家推出了膠體金定量檢測(cè)產(chǎn)品，并將檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)化，與食品安全的大數(shù)據(jù)管理相符合。包括北京智云達(dá)科技股份有限公司在內(nèi)的少數(shù)公司選擇了從另一個(gè)技術(shù)角度解決檢測(cè)卡的定量問題，即時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)。時(shí)間分辨熒光檢測(cè)卡，檢測(cè)的激發(fā)光在300~400nm之間，而發(fā)射光在600~650nm之間，受外部干擾少，所以穩(wěn)定性較好，可更高效的實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。此外，熒光信號(hào)比膠體金的可見光信號(hào)更強(qiáng)，提高了檢測(cè)技術(shù)的靈敏度，進(jìn)而簡(jiǎn)化了前處理過程。

第三，產(chǎn)品的性能。在保證靈敏度的前提下，產(chǎn)品的性能涉及到兩方面內(nèi)容，即檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。在產(chǎn)品研發(fā)過程中，有幾個(gè)節(jié)點(diǎn)非常重要：第一節(jié)點(diǎn)是樣本的選擇，即樣本的適用性。檢測(cè)樣本是產(chǎn)品研發(fā)過程中必然要進(jìn)行的一個(gè)過程，而且產(chǎn)品的最終驗(yàn)證也要落實(shí)到樣本檢測(cè)上。首先，要有通過國(guó)標(biāo)方法確定陰性和陽性的樣本。一些快檢試劑研發(fā)公司為了壓縮研發(fā)時(shí)間，對(duì)于樣本不愿意進(jìn)行足夠的投入，把從超市買來的樣本默認(rèn)為陰性樣本，姑且不說超市的樣本是否真的是陰性樣本，連樣本在存儲(chǔ)過程中真菌毒素的變化情況都有待確證。第二節(jié)點(diǎn)是檢測(cè)體系的穩(wěn)定性。國(guó)外真菌毒素快檢產(chǎn)品的穩(wěn)定性優(yōu)于國(guó)內(nèi)產(chǎn)品，包括檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和有效保存期內(nèi)的穩(wěn)定性。批間差是現(xiàn)有國(guó)內(nèi)免疫產(chǎn)品尤其是真菌毒素膠體金檢測(cè)卡的主要瓶頸，這是產(chǎn)品性能方面關(guān)注的第二個(gè)重要方面。