RNAi技術(shù)在轉(zhuǎn)基因西瓜抗病毒病上的研究與應(yīng)用

李基光，張 屹，肖姬玲，朱菲瑩，梁志懷

（湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410125）

西瓜果實汁多味美，且含有豐富的維生素、糖分等，具有解暑、利尿及降血壓等功效，深受廣大消費者的喜愛。西瓜病毒病作為西瓜3大主要病害之一，在西瓜生產(chǎn)上的危害日趨嚴(yán)重。尤其是近年來西瓜病毒病危害復(fù)雜化，多為幾種病毒同時侵染，癥狀表型不再單一化，使得西瓜病毒病的防治工作的難度增大，在很大程度上制約了西瓜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

因此，有效防控西瓜病毒病，減少病毒危害，提高產(chǎn)量及品質(zhì)，是促進(jìn)西瓜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重中之重。尋找一種新的有效的防控方法，是西瓜生產(chǎn)上亟待解決的關(guān)鍵問題之一。而RNAi技術(shù)的廣泛應(yīng)用，尤其是在植物抗病上的應(yīng)用，為西瓜病毒病的防治提供了新的思路和方法。

1 RNAi技術(shù)概念及研究進(jìn)展

RNAi是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，是生物體內(nèi)的一種通過雙鏈 RNA（dsRNA）分子使特異性序列的 mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的過程。該機(jī)制廣泛存在于真核生物中[1]，由dsRNA、RNA病毒和同源的轉(zhuǎn)基因等誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特定序列的RNA降解機(jī)制，其過程包括沉默啟動、傳導(dǎo)和保持3個階段。RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其普遍性，以及生物學(xué)功能、作用機(jī)制的初步闡明，為 RNAi的廣泛應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)[2]。

目前，RNA沉默已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物抗病和基因功能等方面的研究。

RNAi 的應(yīng)用主要是將病毒基因片段轉(zhuǎn)入寄主，使寄主具有抗病毒特點。依據(jù)病毒來源的dsRNA 可以激活和誘發(fā)植物體內(nèi)的基因沉默系統(tǒng)抵抗病毒侵染這一理論，人們設(shè)想構(gòu)建病毒基因同源序列的雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入植物體內(nèi)用于防御病毒的侵染，從而得到高抗病毒的植株[3]。

近年來，已有一些研究小組開始利用RNAi機(jī)制來進(jìn)行植物病毒分子免疫調(diào)控技術(shù)研究。1998年WATERHOUSE等[4]研究發(fā)現(xiàn)含有馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y ，PVY）正向和反向Pro蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草約45%對PVY有免疫作用。并發(fā)現(xiàn)植物中的RNAi能被自我互補的發(fā)夾RNA（hpRNA）或編碼dsRNA所誘導(dǎo)，并首次證實dsRNA的形成是植物基因沉默的起始關(guān)鍵步驟，并提供了設(shè)計hpRNA的研究方向。人為設(shè)計hpRNA這種類型的遺傳結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入植物以后能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生發(fā)夾RNA，啟動植物體內(nèi)的RNAi，最后降解與雙鏈同源的內(nèi)源mRNA和發(fā)夾RNA的雙鏈區(qū)。

2 西瓜病毒病的危害及其發(fā)生特點

2.1 危害

西瓜病毒病，又稱花葉病、小葉病，全國各種植區(qū)均有發(fā)生。其危害嚴(yán)重，我國每年因西瓜病毒病造成的損失占比30%以上，部分地區(qū)甚至絕產(chǎn)。南北方病害發(fā)生的特點不一樣，南方瓜區(qū)多以蕨葉型病毒病為主，北方瓜區(qū)多以花葉型為主。在設(shè)施長季節(jié)栽培中后期發(fā)生為多，且受害最重。經(jīng)過長期實踐證明，西瓜病毒的危害程度與蚜蟲發(fā)生數(shù)量和種子帶毒率等原因密切相關(guān)。

根據(jù)主要表現(xiàn)癥狀可將西瓜病毒病分為花葉型、黃化型、蕨葉型、皺縮型、葉脈壞死型和混合型等5類。在大田生產(chǎn)中，西瓜受危害表現(xiàn)癥狀類型復(fù)雜，多數(shù)為幾種病毒病同時侵染，常伴有花葉、卷葉、皰斑、線形葉、皺縮、黃化、褪綠等綜合癥狀[5]。

2.2 發(fā)生特點

病毒可潛伏在西瓜種皮、蚜蟲體內(nèi)、雜草或某些作物的宿根上（設(shè)施栽培中某些設(shè)施也是病毒的潛伏點）越冬，翌年在合適的條件下侵染、危害作物。西瓜病毒病在西瓜生育期的各個時期均有可能發(fā)生，其中苗期至開花期容易感病，夏、秋季由于大氣干旱、氣溫高等因素易爆發(fā)。有研究表明蚜蟲與病毒病的發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)，蚜蟲的爆發(fā)是發(fā)病的主要原因之一，每年的5月以后，隨著氣溫日趨變暖，蚜蟲、薊馬等的繁殖、遷飛活動頻繁，加快了病毒的傳播。另外病毒病可通過傷口傳播，比如農(nóng)事操作不當(dāng)或過勤，造成植株太多的傷口，會增加病毒病的發(fā)生率。當(dāng)遇到連續(xù)晴熱干旱、持續(xù)高溫，且瓜地通風(fēng)不暢、缺水時，病害發(fā)生會比較嚴(yán)重。

3 RNAi技術(shù)在防治西瓜抗病毒病上的研究與應(yīng)用

近年來，隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，RNAi技術(shù)在植物抗病毒方面的研究與應(yīng)用也越來越多，在西瓜抗病毒病上的研究也取得了一些進(jìn)展。

3.1 RNAi技術(shù)抗西瓜單一病毒的研究

20世紀(jì)90年代，黃學(xué)森等[6]將WMV的CP基因成功導(dǎo)入西瓜植株，獲得一些抗性材料，經(jīng)檢測，對西瓜WMV的發(fā)生具有一定的抑制作用。王慧中等[7]將 WMV的 CP基因轉(zhuǎn)入西瓜，獲得了抗 WMV的純合系。PARK等[8]將黃瓜綠葉斑駁病毒CP基因的cDNA轉(zhuǎn)化到西瓜中，經(jīng)分子檢測及抗性鑒定，獲得的轉(zhuǎn)基因材料抗黃瓜綠葉斑駁病毒。孫玉宏等[9]利用包含雙元載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化西瓜子葉外植體，獲得具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株。?ürük[10]等將ZYMV-CP基因構(gòu)建反向重復(fù)植物表達(dá)載體，獲得具有抗ZYMV病毒的轉(zhuǎn)基因西瓜新種質(zhì)。HUANG等[11]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有西瓜銀色斑駁病毒的核蛋白基因（WSMOVN）轉(zhuǎn)入西瓜，獲得了抗病毒的轉(zhuǎn)基因植株。

3.2 RNAi技術(shù)抗西瓜多種病毒的研究

隨著氣候的變暖，長期連作等原因，西瓜在大田生產(chǎn)中，常常同時遭受多種病毒的侵害，其中主要有西瓜花葉病毒（WMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）和西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）等，因此單一病毒的轉(zhuǎn)基因抗病材料，在生產(chǎn)上難以取得明顯的防治效果。因此，如何提高大田生產(chǎn)中病毒病的防治效果，同時抗多種病毒病的研究成為熱點與重點。美國 Asgrow種子公司，采用基因工程技術(shù)，將小西葫蘆黃化花葉病毒、黃瓜花葉病毒和西瓜花葉病毒，這3種病毒的CP基因成功轉(zhuǎn)入西葫蘆植株，獲得了抗這3種病毒病的西葫蘆品種[12]，并已獲準(zhǔn)上市。吳會杰等[13]針對危害西瓜的主要病毒（CMV、ZVMV、WMV），構(gòu)建3價植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化西瓜，獲得再生植株，經(jīng)篩選，獲得抗性植株，經(jīng)檢測與鑒定，轉(zhuǎn)基因西瓜可同時抗3種病毒。LIN等[14]將4個病毒外殼蛋白基因片段導(dǎo)入西瓜，經(jīng)檢測，轉(zhuǎn)基因植株可以抗多種病毒。

4 結(jié)語與展望

RNAi技術(shù)在植物中的廣泛應(yīng)用，使得人們對作物的生長發(fā)育現(xiàn)象有著更深入完整的認(rèn)識和了解，從而加快了RNAi技術(shù)在作物抗病毒病上及育種上的應(yīng)用，但RNAi技術(shù)在西瓜抗病毒病上的研究存在一些問題。一是倍性不易控制，易發(fā)生改變。有研究報道組織培養(yǎng)操作能提高材料的自然加倍率[15]，比如以二倍體西瓜為受體，經(jīng)過組織培養(yǎng)操作后，部分植株表現(xiàn)出四倍體西瓜的特性。二是菌株和載體的選擇。對同一植物而言，不同菌株的敏感性也不同，選擇受體植物敏感的菌株及載體是轉(zhuǎn)化成功的重要因素之一[16]。三是外植體的類型確定。西瓜的多種組織（莖段、原生質(zhì)體、葉盤等）可作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，能產(chǎn)生愈傷組織，但都難以形成再生植株。因此，選擇適合的轉(zhuǎn)化受體很重要，是轉(zhuǎn)基因操作取得成功的關(guān)鍵因素之一。四是目前由于缺乏良好的轉(zhuǎn)基因食品安全評價體系，人們受傳統(tǒng)觀念的影響等原因，使得轉(zhuǎn)基因作物在大田推廣及應(yīng)用中存在一定的難度。

這些問題，在一定程度上制約了轉(zhuǎn)基因西瓜抗病毒病的研究與發(fā)展。相信隨著科技的進(jìn)步，RNAi技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，它將會出現(xiàn)新的更廣闊的應(yīng)用前景。

[1]ALVARADO V, SCHOLTHOF HB. Plant responses against invasive nucleic acids：RNA silencing and its suppression by plant viral pathogens[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology,2009,20(9):1032-1040.

[2]FUSARO AF, MATTHEW L, SMITH NA,et al.RNA interference-inducing hairpin RNAs in plants act through the viral defense pathway[J]. EMBO Reports,2006,7 (11):1168-1175.

[3]李基光,王三文,張德詠,等.RNAi技術(shù)的研究及其在植物上的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(8):3897-3899.

[4]WATERHOUSE P M, GRAHRN M W, WANG MB.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95(23):13959-13964.

[5]潘秀清,武彥榮,朱水芳,等.河北省瓜病毒病普查毒原檢測[J].華北農(nóng)學(xué)報,2002,17(2):143．

[6]黃學(xué)森,牛勝鳥,王錫民,等.轉(zhuǎn)基因抗病毒病四倍體西瓜的培育[J].中國瓜菜,2007(6):1-4.

[7]王慧中.轉(zhuǎn)WMV-2外殼蛋白基因西瓜植株的病毒抗性[J].遺傳學(xué)報,2003,30(1):70-75.

[8]PARK SM, LEE JS, JEGAL S, et a1. Transgenic watermelon root stock resistant to CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus)infection [J]. Plant Cell Reports,2005,24(6):350-356.

[9]孫玉宏,韓長磊,張椿雨,等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因西瓜植株[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,26(5):684-688.

[10]?ürük S, Me?e E. Watermelon transformation with Zucchini yellow mosaic virus coat protein gene and comparison with parental cultivar[J]. Pesquisa Agropecuária Brasileira,2012,47(1):66-75.

[11]HUANG Y C, CHIANG C H, LI C M, et a1.Transgenic watermelon lines expressing the nucleocapsid gene of Watermelon silver mottle virus and the role of thiamine in reducing hyper hyperhydricity in regenerated shoots[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture,2011,106(1):21-29．

[12]MARE FUCHS, JAMES R, MCFERSON DM, et al.Cantaloupe line CZW-30 containing coat protein genes of cucumber mosaic virus，zucchini yellow mosaic virus and watermelon mosaic Virus-2 is resistant to those three viruses in the fi eld[J]. Molecular Breeding,1997,3(4):279-290.

[13]吳會杰,劉麗鋒,彭斌,等.西瓜抗病毒RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J].果樹學(xué)報,2009,26(4):525-531.

[14]LIN C Y, KU H M, CHIANG Y H, et a1. Development of transgenic watermelon resistant to Cucumber mosaic virus and Watermelon mosaic virus by using a single chimeric transgene construct[J]. Transgenic Research,2012,21(5):983-993.

[15]ELLUL P, RIOS G, ATARES A, et a1. The expression of the Saccharomyces cerevisiae HAL1 gene increases salt tolerance in transgenic watermelon[Citrullus lanatus (Thunb.) Matsun.＆Nakai.][J]. Theoretical and Applied Genetics,2003,107 (3):462-469.

[16]趙小強(qiáng),牛曉偉,范敏.農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西瓜的影響因素及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2016,28(1):171-178.