桃組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

董曉民，劉偉，胡廣波，王江勇，張安寧*

(1.山東省果樹研究所，山東泰安271000；2.煙臺(tái)市牟平區(qū)農(nóng)業(yè)局)

桃組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

董曉民1，劉偉1，胡廣波2，王江勇1，張安寧1*

(1.山東省果樹研究所，山東泰安271000；2.煙臺(tái)市牟平區(qū)農(nóng)業(yè)局)

從莖尖培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、其他外植體培養(yǎng)等方面對(duì)桃的組織培養(yǎng)研究及遺傳轉(zhuǎn)化現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，為今后桃育種工作提供參考。

桃；組織培養(yǎng)；遺傳；轉(zhuǎn)化

桃是中國(guó)重要的核果類果樹，栽植面積廣闊，果實(shí)色澤艷麗、風(fēng)味鮮美，深受消費(fèi)者喜愛。生產(chǎn)中普遍存在不耐貯運(yùn)、貨架期短、優(yōu)質(zhì)性狀不易獲得等問題，加快優(yōu)良品種的選育成為發(fā)展的關(guān)鍵。

傳統(tǒng)桃樹育種方法存在周期長(zhǎng)、工作量大、雜交胚易敗育等問題，導(dǎo)致育種進(jìn)程緩慢?，F(xiàn)代生物技術(shù)，尤其是植物組織培養(yǎng)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，使得育種工作不受季節(jié)限制、性狀篩選時(shí)間縮短、育種效率大大提高，為桃等核果類果樹的遺傳育種開辟了新的途徑。

1 組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)是利用植物細(xì)胞的全能性，將離體器官誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，繼而產(chǎn)生不定芽、不定根，最后形成完整植株的技術(shù)，在果樹遺傳育種中發(fā)揮重要作用。目前，國(guó)內(nèi)外在桃的組織培養(yǎng)方面已有不少研究，依培養(yǎng)目的不同采用了不同的外植體，如莖尖、腋芽、胚、胚珠、子葉、葉片、花藥、原生質(zhì)體等。大多數(shù)的研究集中于莖尖培養(yǎng)和胚培養(yǎng)方面。

1.1 莖尖培養(yǎng)

莖尖培養(yǎng)是利用莖尖的直接分化途徑獲得再生植株，操作簡(jiǎn)便、培養(yǎng)周期短、能較好地保持植物遺傳穩(wěn)定性，在植物脫毒和快繁中有廣泛應(yīng)用。高春媛等[2]以華光、秦光和曙光油桃進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，其初代培養(yǎng)成活率分別為98.15%、72.34%、91.72%。馬常念等[2]在對(duì)桃砧木的莖尖培養(yǎng)中，東溪小仙桃和砧選1號(hào)初代培養(yǎng)成活率分別為73.33%和76.67%

1.2 胚培養(yǎng)

胚培養(yǎng)技術(shù)在早熟桃育種、克服雜交種胚的早期敗育、誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生、生產(chǎn)無病毒苗木等方面發(fā)揮重要作用。1933年，Tukey等[]首先開展了桃胚培養(yǎng)工作，研究果實(shí)生長(zhǎng)快慢與桃胚大小的關(guān)系。國(guó)內(nèi)桃胚培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)60年代，早熟桃幼胚成苗率可達(dá)50%～60%。朱學(xué)文等[4]利用早熟油桃曙光進(jìn)行胚培養(yǎng)，在木本植物用培養(yǎng)基(WPM培養(yǎng)基)中種胚萌發(fā)率可達(dá)82.9%。萬春雁等[5]對(duì)華光油桃進(jìn)行胚培養(yǎng)獲得91.3%的萌芽率。馮建榮等[6]對(duì)雜交后的早熟蟠桃進(jìn)行胚培養(yǎng)，其成苗率為33.3%。田玲等[7]采用雜交授粉后60 天的扁桃幼胚進(jìn)行胚培養(yǎng)，獲得86.7%的萌發(fā)率。

目前，國(guó)內(nèi)利用桃胚培養(yǎng)技術(shù)已選育出了許多優(yōu)良品系。例如，俞明亮等[8]利用胚挽救技術(shù)選育的早熟油蟠桃紫金早油蟠，蔣海月等[9]選育的極早熟油桃品種超紅珠，陳昌文等[10,11]選育的蟠桃新品種中蟠桃10號(hào)和中蟠桃11號(hào)，陳雙建等[12]選育的錦玉和陳建軍等[13]選育的隴蜜12號(hào)等早熟桃新品種。

1.3 其他外植體培養(yǎng)

除技術(shù)比較成熟的莖尖及胚培養(yǎng)外，桃樹組織培養(yǎng)在胚珠、子葉、葉片、花藥等外植體上也進(jìn)行了研究。胚珠培養(yǎng)或子房培養(yǎng)，可在離體條件下維持幼胚的胚性生長(zhǎng)，提高培養(yǎng)成功率。楚宗麗等[14]以早熟油桃品種早紅2號(hào)、千年紅為材料進(jìn)行胚珠培養(yǎng)，其中早紅2號(hào)在盛花后28天培養(yǎng)的成胚率最高，達(dá)42.86%，盛花后48天培養(yǎng)的不定芽誘導(dǎo)率分別為69.69%、62.50%。孫清榮等[15,16]對(duì)肥城桃、青州蜜桃、冬桃的成熟胚子葉進(jìn)行培養(yǎng)，獲得不定梢再生率分別為78%、66.7%和56.2%。孫躍峰等[17]以花后60天的華光及花后68天的曙光子葉為外植體，分別得到75.0%和66.7%的再生率。

2002年，Gentile等[18]首次實(shí)現(xiàn)桃葉片再生不定芽，再生率達(dá)28.3%。叢芳等[19]以曙光和金童5號(hào)的試管苗葉片為外植體，分別獲得14.5%和21.8℅的離體再生率。田國(guó)棟等[20]以97-8-4、甜桃王和布目早生為材料進(jìn)行葉片再生研究，不定芽再生率分別為18.33%、16.67%和13.33%。

利用花藥或未授粉子房培養(yǎng)可獲得植株純系，提高選擇優(yōu)良基因型的效率，加速獲得遺傳性一致且穩(wěn)定的群體。Michellon等對(duì)桃和扁桃花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，在液體Miller培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出倍性不同的愈傷組織，但未獲得再生植株[21]。

2 遺傳轉(zhuǎn)化

遺傳轉(zhuǎn)化是利用載體或物理化學(xué)方法將目的基因轉(zhuǎn)入宿主，經(jīng)篩選獲得抗病蟲、抗逆、品質(zhì)優(yōu)良等所需性狀的新品種的技術(shù)。常用方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法。

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

該法通過根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，簡(jiǎn)單高效、重復(fù)性好，是主要的轉(zhuǎn)化方法。1987年，Smigicki等[22]首次進(jìn)行桃轉(zhuǎn)基因工作，獲得了轉(zhuǎn)化的桃細(xì)胞及愈傷組織。Scorza等[23]利用農(nóng)桿菌分別轉(zhuǎn)化葉圓片、未成熟胚和長(zhǎng)期胚性愈傷組織，均獲得成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織。吳延軍等[24]以奉化玉露桃為試材分別用根癌農(nóng)桿菌和基因槍兩種方法以桃幼胚子葉為受體進(jìn)行基因片段轉(zhuǎn)化，首次獲得桃轉(zhuǎn)ACO反義基因的抗性材料。微芽嫁接后，因生根困難未獲得長(zhǎng)期保存植株。張亞林等[25]以白粉桃莖段為轉(zhuǎn)化受體，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將反義多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因?qū)?，篩選獲得轉(zhuǎn)化植株。張荷芃[26]以秦光2號(hào)和97-8-4桃的下胚軸為試材進(jìn)行PpLox-3基因遺傳轉(zhuǎn)化，初步獲得轉(zhuǎn)基因體系。

2.2 基因槍轟擊轉(zhuǎn)化

該轉(zhuǎn)化方法是在高壓作用下將包被在微粒表面的外源DNA射入受體細(xì)胞，通過整合到植物染色體上實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)。1994年，Ye等[27]通過基因槍轟擊桃胚軸、子葉、未成熟胚、莖尖、葉片等材料，進(jìn)行GUS/NPTⅡ嵌合基因轉(zhuǎn)化。經(jīng)檢測(cè)均獲得成功轉(zhuǎn)化的抗性愈傷組織，但未誘導(dǎo)出轉(zhuǎn)基因芽。

2.3 花粉管通道法轉(zhuǎn)化

該法是利用植物在開花、受精時(shí)形成的花粉管通道將外源DNA導(dǎo)入，并隨著受精卵發(fā)育而獲得轉(zhuǎn)基因新個(gè)體。目前已在小麥、水稻、棉花、大豆等作物上應(yīng)用并獲得轉(zhuǎn)基因植株。2009年，萬春雁等[28]以曙光油桃為試材進(jìn)行桃花粉管通道法轉(zhuǎn)基因研究，確定外源DNA的注射時(shí)間及適宜濃度。因花柱橫切滴加法注射外源質(zhì)粒DNA效果不理想，導(dǎo)致幼果提前脫落，未能驗(yàn)證外源DNA是否成功導(dǎo)入。

3 小結(jié)與展望

目前，桃組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化的研究已取得一定的進(jìn)展。中國(guó)桃育種工作者利用胚培養(yǎng)技術(shù)，選育出了一批早熟桃新品系。桃離體快繁體系的建立也為工廠化育苗、培育脫毒苗奠定了基礎(chǔ)。但桃胚培養(yǎng)中還存在成苗率低、胚培苗移栽技術(shù)不夠完善等問題，限制了桃的育種效率，提高了雜交育種成本。還應(yīng)不斷改進(jìn)胚培養(yǎng)技術(shù)，加大影響移栽成活關(guān)鍵因素的研究。另外，桃因缺乏高效、穩(wěn)定的再生體系，多數(shù)遺傳轉(zhuǎn)化僅能獲得轉(zhuǎn)基因的愈傷組織及抗性芽，未能獲得轉(zhuǎn)基因植株。積極探索更有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法，建立高效的、經(jīng)愈傷組織或胚狀體途徑的再生體系也成為今后研究的重點(diǎn)。

[1] 高春媛,韓明玉,田玉命,等.影響油桃莖尖初代培養(yǎng)的因素研究[J].西北農(nóng)業(yè)報(bào),2008,17(2):174-178.

[2] 馬常念,張慧琴,肖金平,等.三種桃砧木莖尖培養(yǎng)技術(shù)的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)報(bào),2013,25(3):503-508.

[3] 陳正華主編.木本植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用[M].北京:高等教育出版社,1986.290-314.

[4] 朱學(xué)文, 李曉倩. 早熟油桃胚培養(yǎng)研究初探[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(4):54-55.

[5] 萬春雁,韓明玉,趙彩平,等.不同成熟期桃胚培養(yǎng)的相關(guān)影響因子研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(1):248-251.

[6] 馮建榮,吉燕,樊新民,等. 早熟蟠桃的胚培養(yǎng)[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào),2009,27(1):23-26.

[7] 田玲,郭春會(huì),羅夢(mèng),等. 扁桃雜交幼胚培養(yǎng)初報(bào)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,16(3):116-118.

[8] 俞明亮,馬瑞娟,許建蘭,等.早熟油蟠桃新品種‘紫金早油蟠’[J].園藝學(xué)報(bào),2012,39(6):1203-1204.

[9] 蔣海月,劉佳棽,王尚德,等. 油桃極早熟白肉新品種超紅珠的選育[J].中國(guó)果樹,2012,(6):4-5.

[10] 陳昌文,朱更瑞,王力榮,等. 蟠桃新品種‘中蟠桃10號(hào)’的選育[J].果樹學(xué)報(bào),2015,32(2):339-340.

[11] 陳昌文,朱更瑞,王力榮,等. 蟠桃新品種‘中蟠桃11號(hào)’[J].園藝學(xué)報(bào),2015,42(10):2089-2090.

[12] 陳雙建,董冰,楊萍,等.早熟桃新品種‘錦玉’[J].園藝學(xué)報(bào),2014,41(2):389-390.

[13] 陳建軍,王發(fā)林,王鴻,等.早熟桃新品種‘隴蜜12號(hào)’的選育[J].果樹學(xué)報(bào),2016,33(7):895-897.

[14] 楚宗麗.核果類果樹胚珠培養(yǎng)及子葉再生體系構(gòu)建[D].河南:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所,2007.

[15] 孫清榮,石蔭坪,孫洪雁,等.肥城桃幼子葉不定植株再生[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào),1999,30(4):395-397.

[16] 孫清榮,孫洪雁,石蔭坪.青州蜜桃、冬桃成熟胚子葉再生不定植株的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,(2):11-12.

[17] 孫躍峰,韓明玉,范崇輝,等.油桃子葉再生植株影響因子研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,32(4):66-70.

[18] Gentile A,Monticell S,Damiano C,etal.Adventitious shoot regeneration in peach[Prunus persica (L.) Batsch][J].Plant Cell Rep,2002,20(11):1011-1016.

[19] 叢芳,韓明玉,趙彩平,等.桃葉片再生不定芽的研究[J].果樹學(xué)報(bào),2009,26(5):614-618.

[20] 田國(guó)棟,張荷芃,康卓慧,等.桃葉片再生不定芽的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,39(2):125-132.

[21] 楊寧,楊紅,楊穎麗,等.核果類果樹組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,41(1):94-100.

[22] Smigochi A C,Owins L D,Hammerschlag F A,etal.In vitro transformation of peach (Prunus persica L.) Batsch.using A grobacterium tumefaciens[J].HortScience,1987,(22):814-819.

[23] Scorza R,Morgens P H, Cordts J M,etal.Agrobacterium-mediated transformation of peach (Prunus persica Batsch) leaf segments,immature embryos,and long-term embryogenic callus[J].In Vitro Cell Dev.Biol.1990,26:829-834.

[24] Wu YJ,Zhang SL,Xie M,etal.Genetic transformation of peach immature cotyledons with its antisense ACO gene[J].Yi Chuan,2006,28(1):65-70.

[25] 張亞林,李唯,張偉,等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)反義PG基因?qū)μ业倪z傳轉(zhuǎn)化[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,45(6):55-59.

[26] 張荷芃.桃體細(xì)胞胚發(fā)生的觀察和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化體系的篩選[D].陜西:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012.

[27] Ye X J, Brown S K, Scorza R, etal. Genetic transformation of peach tissues by particle bombardment[J].J Amer Soc Hort Sci,1994,119(2):367-373.

[28] 萬春雁,韓明玉,趙彩平,等.桃花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)的初步研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25(5):38-42.

2016-09-22

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-31)，山東省名優(yōu)稀果品高檔化與標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究(2014CXZ04)。

董曉民(1988-)，女，山東泰安人，研究實(shí)習(xí)員，研究方向?yàn)樘矣N與生物技術(shù)。E-mail:dxm1209@163.com

S662.1

A

1002-2910(2017)04-0017-03

*通訊作者：張安寧(1974-)，男，山東泰安人，副研究員，研究方向?yàn)楣麡溆N與栽培。