斷奶仔豬副豬嗜血桿菌分離鑒定與藥敏試驗

許英民

（黑龍江省鐵力市獸醫(yī)專家門診 黑龍江伊春 152500）

斷奶仔豬副豬嗜血桿菌分離鑒定與藥敏試驗

許英民

（黑龍江省鐵力市獸醫(yī)專家門診 黑龍江伊春 152500）

黑龍江省鐵力市某原種豬場，有 216 頭斷奶仔豬，對其中患病仔豬進行臨床及剖檢的觀察疑似副豬嗜血桿菌感染對該病例進行詳細分離，通過細菌分離形態(tài)培養(yǎng)、生化試驗、PCR 鑒定和藥敏試驗等，確定該分離菌株為副豬嗜血桿菌。測定該臨床上常用抗菌藥物對分離菌株的敏感性，結果顯示，對頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、頭孢噻肟敏感，對頭孢噻吩、氨芐青霉素、新霉素、頭孢三嗪等 8 種藥物耐藥性，說明分離菌株抗藥性比較嚴重。所以，提示臨床防治該病時，應根據藥敏試驗結果進行防治。

斷奶仔豬；副豬嗜血桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

副豬嗜血桿菌病又稱豬多漿膜炎綜合征、或稱豬纖維蛋白性漿膜炎和關節(jié)炎、革拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌（H.parasuis）引起的，在臨床上以體溫升高、關節(jié)腫脹、呼吸困難、多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和高死亡率為主要特征的傳染病，危害仔豬和保育豬的健康。尤其是在經高致病性藍耳病等免疫抑制性疫病發(fā)生并引起免疫功能下降后，副豬嗜血桿菌病更為嚴重，使豬場蒙受更大的經濟損失。副豬嗜血桿菌可以影響2周齡至3月齡的仔豬和保育豬，多發(fā)生在斷奶前后和保育期的豬，一般常見 5～7周齡的豬，死亡率一般在 15～19%，嚴重時可達 50%左右。最近筆者在某原種豬場進行診斷，對該場斷奶仔豬發(fā)生的疑似病例，進行菌株的分離鑒定，為該病的防治提供依據。

1 材料

1.1 病料來源

在黑龍江省鐵力市某原種豬場出現的副豬嗜血桿菌病疑似癥狀中，采用無菌采集病死斷奶仔豬的心、肝、脾、肺和淋巴結等器官組織和關節(jié)積液。

1.2 主要儀器

高壓滅菌器、生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺、顯微鏡、冰箱、常用玻璃器材等。

1.3 主要試劑

副豬嗜血桿菌標準抗血清，購自中國獸醫(yī)藥品檢查所；麥康凱瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、鮮血瓊脂、伊紅美蘭瓊脂、普通肉湯、生化發(fā)酵管、藥敏紙片等，均由我們實驗室提供。

1.4 實驗動物

試驗小白鼠購自小動物飼養(yǎng)場，斷奶仔豬由黑龍江省鐵力市某原種豬場提供。

2 方法

2.1 涂片鏡檢

用病死斷奶仔豬的肝臟、心血、關節(jié)積液，分別涂片或沫片，革蘭氏染色，鏡檢。

2.2 細菌分離培養(yǎng)

取病死斷奶仔豬的肝臟、心包液、腦組織、關節(jié)液、分別接種普通營養(yǎng)瓊脂、巧克力瓊脂，鮮血瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基上，經 37℃培養(yǎng) 24～48h。再挑取平板上針尖大小、透明的小菌落，劃線于巧克力瓊脂平板上。挑取菌落進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。

2.3 生化試驗

將分離到的純培養(yǎng)菌株分別接種于蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蛋白胨、山梨醇、甘露醇、尿素酶生化鑒定試管內，每個試管中加入 1μm0.3%NAD（煙酰胺嘌呤二核苷酸），置于 37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng) 24h, 待觀察生化反應。

2.4 PCR鑒定

根據有關文獻合成下列引物，即 P1：5′-TATCGRGAGATGAAAGAC-3,P2：5′ -GTAATGTCTAAGGACTAG-3′ ,P3：5′-CCTCGCGGCTTCGTC-3′ ，擴增產物為 1090bp 左右的片段，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察檢測結果。

2.5 藥敏試驗

按 K-B 紙片擴散法將被檢細菌涂布接種于普通瓊脂平板上，間隔一定距離貼上各種藥敏試紙，于 37 ℃培養(yǎng) 16～18h 后，觀察結果。

3 結果

3.1 病料檢查

病料涂片檢查，采用無菌操作取病死豬的肝臟、心包液、腦組織、關節(jié)液涂片，革蘭氏染色，鏡檢，可見長絲狀、球狀的細菌。

3.2 細菌分離與培養(yǎng)

可觀察到在巧克力瓊脂平板上長出針尖大小、無色透明、光滑濕潤、邊緣整齊而呈圓形的菌落。取菌落涂片，用革蘭氏染色，可見長絲狀、桿狀、球狀等多形態(tài)的短小革蘭氏陽性桿菌，多單個存在或呈短鏈狀排列。與直接涂片鏡檢的結果相同。另挑取該菌落接種于兔血瓊脂平板上，再用金黃色葡萄球菌點種，呈現“衛(wèi)星生長”現象。

3.3 生化試驗

分離到的菌株能發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、葡萄糖，而蛋白胨、山梨醇、甘露醇、尿素酶生化反應為（-），不能發(fā)酵分解乳糖、甘露醇。

3.4 PCR檢測結果

分離菌株提取的 DNA 樣品經 PCR 擴增，在 1090bp 的位置出現特異的條帶，與之前各文獻上報道的副豬嗜血桿菌 PCR 檢測結果一致，分離菌株被鑒定為副豬嗜學桿菌。

3.5 藥敏試驗

根據藥敏紙片標簽說明，抑菌圈在 0～10mm 為低敏，10～15mm 為中敏，15mm 以上為高敏。根據該判定標準，結果抑菌圈在 15mm 以上，即為高敏的藥物有，頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林；抑菌圈在 10～15mm 為中敏的有丁胺卡那霉素、頭孢氨芐、新霉素；抑菌圈在 0～10mm，即為低敏的有鏈霉素、多粘菌素、復方新諾明。

4 小結與討論

副豬嗜血桿菌病是豬的重要細菌性疾病之一，屬于條件性細菌病，細菌侵入于上呼吸道內，可受其他疾病繼發(fā)、環(huán)境應激等多種因素的誘發(fā)，使得病情加重。近些年來，呈愈演愈烈的趨勢。該菌可通過空氣直接接觸感染其健康豬，也可通過消化道傳播。在冬春季節(jié)此病多發(fā)，豬場內環(huán)境條件差、營養(yǎng)不佳和管理不善等因素均可引起發(fā)病。

由于本病為機體常在菌，如果抵抗力低下，就會引起發(fā)病。對于新購入的仔豬，無論運輸、飼喂及生長環(huán)境突然改變，均使應激因素增加，導致豬群抵抗力下降，將會引起發(fā)病。因此，最好是堅持“自繁自養(yǎng)”，是預防本病發(fā)生的重要措施之一。在引進時應確保不從疫區(qū)引進生豬，保證引進健康的豬。購回后不要急于混群，應隔離一段時間，確定健康后再混群飼養(yǎng)。

臨床上，副豬嗜血桿菌常發(fā)生于豬其他疾病，如豬藍耳病、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型等疫病。平時應做好對其他疾病的免疫，以防繼發(fā)感染。豬發(fā)病后要早診斷、早治療，采取綜合防治措施，使疫情盡快得到控制，減少不必要的經濟損失。

在本試驗中，根據發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化，以及細菌培養(yǎng)和 PCR 鑒定進行綜合診斷，確診為副豬嗜血桿菌病。在該病的防治上，一般在臨床上都采用疫苗注射和抗菌素治療，由于大量使用抗菌素，導致細菌耐藥性的產生，使該病的預防和治療表現更加困難。本試驗對多種抗菌素藥物的耐藥性進行測定，結果顯示流行菌株對多種藥物已產生耐藥性，如丁胺卡那霉素、新霉素、頭孢芐胺、鏈霉素、多粘菌素、復方新諾明等；僅對比較少數藥物較敏感，如頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林等。在防治副豬嗜血桿菌病時，建議應以疫苗為主，可根據藥敏試驗進行交叉使用抗菌素，并配合中藥制劑效果會更好。

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[3]萬世平,王建,葛菲菲,等.副豬嗜血桿菌分離株的生物學特性與基因型分析[J].畜牧與獸醫(yī),2010,42（4）:65-69.

[4]東北農業(yè)大學.獸醫(yī)臨床診斷學（第 3版）[M]北京：中國農業(yè)出版社,2001.

[5]蔡寶祥.家畜傳染病學（第 4 版）[M]北京：中國農業(yè)出版社,2001.

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.02.014