光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)真菌生物膜的作用研究進(jìn)展

張莉 李秀麗

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院皮膚科，上海 200072)

·綜述·

光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)真菌生物膜的作用研究進(jìn)展

張莉 李秀麗

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院皮膚科，上海 200072)

生物膜是一種附著于活組織或無(wú)活力組織的表面、由菌體產(chǎn)生的細(xì)胞外多聚基質(zhì)包裹的有結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體。近年來(lái)，有研究表明隨著真菌耐藥性的增加，65%的感染與生物膜的形成有關(guān)，光動(dòng)力療法作為一種新型非侵入性療法，具有精確靶向特性，已廣泛用于實(shí)體腫瘤的治療，目前人們發(fā)現(xiàn)其對(duì)真菌生物膜的治療方面有良好的前景。該文就光動(dòng)力療法對(duì)真菌生物膜的作用進(jìn)行綜述，旨在讓大家對(duì)光動(dòng)力抗真菌治療有一個(gè)全面深入的了解。

光動(dòng)力療法；真菌；生物膜；耐藥性

1 光動(dòng)力學(xué)療法的概念及光動(dòng)力學(xué)療法的作用機(jī)制

1.1 光動(dòng)力學(xué)療法的概念

光動(dòng)力學(xué)療法 (photodynamic therapy)是一種新型的光療方法，包括系統(tǒng)和局部應(yīng)用光敏化合物，該光敏化合物可優(yōu)先被靶細(xì)胞所吸收，然后以可見(jiàn)光對(duì)皮損進(jìn)行選擇性照射。簡(jiǎn)單地說(shuō)就是利用光敏分子產(chǎn)生的細(xì)胞毒性氧自由基達(dá)到治療目的的一種技術(shù)。

1.2 光動(dòng)力療法的作用機(jī)制

光動(dòng)力療法必要組成部分包括：光敏化的光源、外源性光敏劑、組織氧和靶器官。首先，光敏劑進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)或者黏附到細(xì)胞表面，然后通過(guò)特定波長(zhǎng)的光激發(fā)光敏劑,傳遞能量給氧氣進(jìn)而產(chǎn)生活性氧,從而誘導(dǎo)細(xì)胞器的光化學(xué)損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1]。

2 真菌生物膜的形成過(guò)程及其耐藥性

各種真菌的生物膜形成過(guò)程不盡相同，但大致可以分為以下幾個(gè)步驟：①菌體與支撐物表面的黏附；②形成微菌落，微菌落融合并形成生物膜的基底層；③基質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，同時(shí)隨菌絲或假菌絲的形成；④結(jié)構(gòu)逐漸復(fù)雜，發(fā)育為成熟的生物膜；⑤真菌從生物膜上脫落，形成新的生物膜。近年來(lái)，由于復(fù)雜的生物膜結(jié)構(gòu)的形成，真菌的耐藥性也大大地增加。有研究表明，真菌形成生物膜以后，對(duì)兩性霉素B和氟康唑的敏感性降低了20～100倍[2-3]。關(guān)于耐藥機(jī)制的研究也很多，主要?dú)w納為生物膜細(xì)胞外基質(zhì)抑制了抗真菌藥物的擴(kuò)散使其無(wú)法進(jìn)入生物膜內(nèi)部，特殊基因的表達(dá)，代謝活動(dòng)減緩，小部分亞細(xì)胞群的出現(xiàn)，細(xì)胞膜組成的改變[4-5]。

3 光動(dòng)力療法對(duì)真菌及其生物膜的作用

3.1 對(duì)生物膜形成的作用

光動(dòng)力療法可以有效阻礙生物膜的形成。Soares等[6]體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)PDT在抑制芽管和生物膜形成、降低念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞黏附性方面效果明顯，經(jīng)TBO-LED介導(dǎo)的光動(dòng)力療法處理后，對(duì)氟康唑耐藥的白念珠菌IB05和熱帶念珠菌CG09的菌落形成單位分別減少了Log10 3.54和Log10 1.95，同時(shí)還阻止了61%和66%白念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附。Khan等[7]用XTT實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過(guò)24 h的治療，亞甲藍(lán)光動(dòng)力療法可以抑制81.9%的生物膜的形成，同時(shí)結(jié)合納米金顆粒的話，可以抑制95.4%的生物膜的形成。

Dovigo等[8]用結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)來(lái)處理標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)經(jīng)光動(dòng)力療法處理過(guò)的標(biāo)本生物膜的生物量明顯低于陰性對(duì)照組，也就表明光動(dòng)力療法可使部分生物膜從支撐物表面脫離。Soares等[9]以隱球菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用甲苯胺藍(lán)結(jié)合發(fā)光二極管的光動(dòng)力療法做體外實(shí)驗(yàn)得到相似的結(jié)論。

3.2 對(duì)基因表達(dá)的作用

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌，新生隱球菌，煙曲霉等真菌生物膜的形成過(guò)程錯(cuò)綜復(fù)雜，受多種調(diào)控機(jī)制的影響。并且真菌生物膜細(xì)胞的基因表達(dá)與浮游細(xì)胞不同。以白念珠菌為例，在白念珠菌生物膜中，分泌性天冬氨酸蛋白酶 (SAP)，磷脂酶B (PLB),脂肪酶 (LIP)，菌絲壁蛋白1 (Hwp1)，凝集素樣序列 (ALS)等基因在白念珠菌生物膜中持續(xù)表達(dá)，且與游離菌相比，其中大部分基因表達(dá)水平有所上調(diào)[10]。

分泌型天冬氨酸蛋白酶和磷脂酶是白念珠菌產(chǎn)生的胞外酶的兩大家族,SAP具有較高的蛋白酶水解活性，可通過(guò)降解黏膜表面的多種保護(hù)分子 (如黏蛋白等)為白念珠菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)增加其黏附和侵入能力。磷脂酶則可促進(jìn)白念珠菌在體內(nèi)的入侵、存活和致病，還可逃避宿主的免疫防御機(jī)制。細(xì)胞外脂肪酶的作用為真菌獲取營(yíng)養(yǎng)消化脂類(lèi)，黏附宿主細(xì)胞和組織，協(xié)同與其他酶的相互作用，通過(guò)影響免疫細(xì)胞啟動(dòng)炎癥反應(yīng)和通過(guò)溶解競(jìng)爭(zhēng)菌群達(dá)到自我防御的目的。nailis等[11]研究已經(jīng)證實(shí)與懸浮態(tài)相比，存在SAP5，LIP9，PLB2的過(guò)度表達(dá)。

Fernanda等[12]研究了亞甲藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法對(duì)以上基因的表達(dá)情況的影響。結(jié)果表明SAP5基因的表達(dá)減少了60%，LIP9和PLB2基因的表達(dá)減少了50%，但與對(duì)照組相比并沒(méi)有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該實(shí)驗(yàn)證明以亞甲藍(lán)為光敏劑的光動(dòng)力療法對(duì)基因的表達(dá)僅有輕微的作用。該項(xiàng)研究首次闡明光動(dòng)力療法對(duì)念珠菌生物膜基因表達(dá)的影響，此方面的工作仍需要進(jìn)一步的探究。

3.3 對(duì)生物膜內(nèi)菌體的影響

光動(dòng)力學(xué)療法是一種細(xì)胞毒性治療方法,它能引起細(xì)胞凋亡或壞死。ShiH等[13]以白念珠菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用LIVE/DEAD Fungalight Yeast Viability Kit包括PI和STYO 9來(lái)評(píng)估生物膜內(nèi)細(xì)胞的生存能力，并對(duì)死菌和活菌進(jìn)行定量研究，其中SYTO 9可通過(guò)所有真菌的細(xì)胞膜并將其染成綠色，而PI僅可通過(guò)受損的細(xì)胞膜，并替換出SYTO9將其染成紅色。避光染色15 min，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察可見(jiàn)，對(duì)照組只可見(jiàn)綠色熒光的活菌，經(jīng)ALA-PDT處理后，死菌數(shù)量明顯增加，視野逐漸變?yōu)榧t色，當(dāng)光照達(dá)到300 J/cm2時(shí)，抑菌效果最明顯，抑菌率達(dá)到74.45%。有作者得到了相似的結(jié)論，Gao L等[14]以鐮刀菌屬和外瓶霉屬真菌為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法可以有效抑制懸浮態(tài)和生物膜狀態(tài)的真菌的生長(zhǎng)，同時(shí)還得出光動(dòng)力療法可以大大降低抗真菌藥的最低抑菌濃度，從而預(yù)測(cè)此方法將有望縮短治療時(shí)間，降低藥物劑量，和減少藥物毒性，但仍需大量的體內(nèi)和臨床試驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

郭慶玲等[15]則在透射電鏡下觀察念珠菌生物膜超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法處理后出現(xiàn)細(xì)胞變形、細(xì)胞器溶解及胞漿內(nèi)空泡性變等現(xiàn)象。由于許多光敏劑都可以通過(guò)細(xì)胞膜，并進(jìn)行不同的亞細(xì)胞定位，當(dāng)使用一定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光照射時(shí)，一些細(xì)胞內(nèi)成分將被活性氧的氧化產(chǎn)生細(xì)胞器溶解，細(xì)胞變形等現(xiàn)象，從而影響細(xì)胞的功能和代謝，最終引起細(xì)胞凋亡[16]。

Dovigo等[8]利用體外實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估姜黃素介導(dǎo)的光動(dòng)力療法對(duì)真菌生物膜代謝活性的影響，結(jié)果證明當(dāng)姜黃素的濃度40 μM，光照能量18 J/cm2時(shí)，白念珠菌、平滑念珠菌和熱帶念珠菌的代謝活性分別降低了85%、85%和73%，同時(shí)生物膜的生物量也有所下降。Dovigo另一項(xiàng)研究也得到了類(lèi)似的結(jié)論[17]，但是也發(fā)現(xiàn)光動(dòng)力療法對(duì)巨噬細(xì)胞也有一定的殺傷作用，巨噬細(xì)胞的代謝活性也下降了86%。針對(duì)這個(gè)缺點(diǎn)，有人發(fā)現(xiàn)使用特殊的抑制劑可以提高光動(dòng)力療法的選擇性，從而降低其對(duì)宿主正常細(xì)胞的毒性[18]。

3.4 對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)的作用

生物膜是有機(jī)的三維結(jié)構(gòu)，以新生隱球菌為例，用共聚焦激光掃描顯微鏡 (CSLM)觀察其生物膜的形成早期可見(jiàn)酵母細(xì)胞和出芽孢子在載體表面形成單層結(jié)構(gòu)，中期逐漸形成菌落，成熟期產(chǎn)生大量莢膜多糖和細(xì)胞外物質(zhì)，將大量酵母細(xì)胞連成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[19]。有作者用掃描電鏡觀察PVC材料表面白念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜的結(jié)構(gòu)，也發(fā)現(xiàn)了復(fù)雜的多層次網(wǎng)狀生物膜[20]。生物膜復(fù)雜的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得抗真菌藥物無(wú)法直接作用于內(nèi)部的真菌。一些研究表明，光動(dòng)力療法不僅可以直接殺傷生物膜內(nèi)的細(xì)胞，也可以破壞生物膜的結(jié)構(gòu)[21-22]。

孫紅英等[23]通過(guò)CLSM觀察可以明顯發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)不同光劑量的光照后，生物膜結(jié)構(gòu)隨劑量增加而逐漸疏松。當(dāng)光劑量為100 J/cm2時(shí)，生物膜結(jié)構(gòu)開(kāi)始疏松，真菌菌絲縮短。當(dāng)光劑量為200 J/cm2時(shí)，生物膜結(jié)構(gòu)更加疏松，菌絲逐漸斷裂。當(dāng)光劑量達(dá)300 J/cm2時(shí)，生物膜結(jié)構(gòu)基本消失，真菌呈現(xiàn)微菌落分布。通過(guò)CLSM自帶的三維成像立體分析生物膜平均厚度，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中生物膜厚度隨光照劑量增加而減少，其他處理組生物膜厚度基本不變。Khan等[7]的研究也得到同樣的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)納米金裝載亞甲藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法處理后，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)生物膜的短縮，菌絲破裂和生物膜規(guī)則空間三維結(jié)構(gòu)的消失。

4 展 望

生物膜導(dǎo)致多種病原真菌耐藥性的提高，使臨床感染的治療效果下降，已成為臨床最棘手的問(wèn)題之一。各國(guó)科學(xué)家的研究?jī)?nèi)容也轉(zhuǎn)向不依靠抗生素和其他細(xì)胞生物學(xué)傳統(tǒng)方法抗真菌感染。光動(dòng)力療法將不同波長(zhǎng)的可見(jiàn)光照射光敏劑殺滅真菌，安全可靠，而且可以消除生物膜上的病原體。未來(lái)新型光敏劑的研發(fā)及其代謝問(wèn)題，新型光敏劑對(duì)不同微生物的靶向性問(wèn)題，激光光源最適應(yīng)光敏劑的波段選擇，機(jī)體對(duì)光動(dòng)力治療過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)問(wèn)題等，這些方面如果能進(jìn)一步研究和解決，會(huì)是一個(gè)碩果累累的研究方向。

隨著機(jī)制的闡明、實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，相信在不久的將來(lái)，光動(dòng)力療法將應(yīng)用于臨床，成為治療耐藥真菌感染性疾病的新療法。

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R

B

1673-3827(2017)12-0318-03

張莉，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:1984587991@qq.com

李秀麗,E-mail:xiuixu_li@126.com

2016- -

[本文編輯] 王 飛