夏枯草配方顆粒高效液相色譜特征圖譜研究

胡 蓮，周 杰，袁 慧

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川 瀘州 646000）

夏枯草配方顆粒高效液相色譜特征圖譜研究

胡 蓮，周 杰，袁 慧

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川 瀘州 646000）

目的建立夏枯草配方顆粒高效液相色譜（HPLC）特征圖譜。方法色譜柱采用Welch Materials AQ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相為乙腈－0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.8 mL／min，檢測波長為280 nm，進(jìn)樣量為10 L。結(jié)果建立了夏枯草配方顆粒的特征圖譜，標(biāo)定其中6個(gè)特征峰，以迷迭香酸參照峰的保留時(shí)間為1 min，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間分別為0.260(峰1)，0.404 (峰2)，0.540(峰3)，1.000(峰4)，1.360(峰5)，1.836(峰6)，13批夏枯草配方顆粒樣品檢測均符合規(guī)定。結(jié)論該方法簡便、穩(wěn)定，重復(fù)性好，可作為夏枯草配方顆粒的鑒別依據(jù)。

夏枯草；配方顆粒；特征圖譜；高效液相色譜法

中藥配方顆粒是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，采用現(xiàn)代科技手段，將傳統(tǒng)中藥飲片按一定生產(chǎn)工藝制成的提取物，與適當(dāng)輔料或藥材細(xì)粉制成的供臨床調(diào)劑使用的粉狀或顆粒狀產(chǎn)品。其突破了傳統(tǒng)中藥飲片需要煎煮的服用模式，既滿足臨床辨證論治和隨證加減的需要，又具有免煎易服、易儲存、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)[1－3]。2001年，我國開始正式將中藥配方顆粒納入中藥飲片管理范疇[4]。目前，國內(nèi)越來越多的中醫(yī)院開始接受中藥配方顆粒，這一“新型飲片”已逐漸得到患者和醫(yī)生的認(rèn)可[5]。中藥飲片經(jīng)過一系列制劑工藝加工制成配方顆粒后，失去了原飲片的許多外觀、顯微及理化特征，無法再用常規(guī)的技術(shù)手段(如顯微觀察、理化反應(yīng))進(jìn)行有效鑒別。因此制訂特征性強(qiáng)、準(zhǔn)確表征配方顆粒劑的質(zhì)量控制方法顯得尤為重要[6－8]。特征圖譜是中藥配方顆粒的一個(gè)重要質(zhì)量指標(biāo)[9]，但是如何獲得專屬性強(qiáng)、可靠性高、可以準(zhǔn)確表征配方顆粒質(zhì)量的特征圖譜，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。對中藥配方顆粒進(jìn)行特征圖譜研究，有助于改善真?zhèn)坞y辨、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一的狀況。

夏枯草為唇形科植物夏枯草 Prunella vulgaris L.的干燥果穗，味苦、性寒、辛，具有清肝、明目、散結(jié)、消腫、止痛之功效，用于目赤腫痛、目珠夜痛、羞明流淚、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰腫痛[10－13]，現(xiàn)代臨床多用于治療甲狀腺腫大、淋巴結(jié)核、乳腺增生、高血壓、肺結(jié)核、急性黃疸型傳染性肝炎等疾病[14]。夏枯草配方顆粒是夏枯草單味藥經(jīng)煎煮、濃縮、干燥等步驟制成質(zhì)量均一的顆粒劑，其性味、歸經(jīng)、功效與原飲片基本一致，用于中醫(yī)臨床配方[15]。本研究建立夏枯草配方顆粒的高效液相色譜(HPLC)特征圖譜，標(biāo)定了6個(gè)特征峰，并指認(rèn)了其中2個(gè)特征峰的結(jié)構(gòu)，可為夏枯草配方顆粒的采購、生產(chǎn)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀(包括QuatPump四元泵、VWD紫外檢測器、ChemStation工作站(美國Agilent公司)；GR－202型電子分析天平(日本)；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

迷迭香酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111871－201404）；13批不同廠家夏枯草配方顆粒由本院提供，編號為S1～S13；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WelchMaterialsAQ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：280 nm；柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.80 mL／min；流動相：乙腈－0.1%磷酸，梯度洗脫，見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序表

2.2 溶液制備

參照物溶液：精密稱取迷迭香酸對照品適量，加稀乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供試品溶液：取夏枯草配方顆粒粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率 50 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 共有峰標(biāo)定及相似度計(jì)算

根據(jù)13批夏枯草配方顆粒樣品(S1～S13)的高效液相色譜所給出的相關(guān)參數(shù)，比較樣品色譜圖。其中各批樣品共有的峰有6個(gè)，確定為共有峰。在共有峰中，以迷迭香酸峰(S峰)的保留時(shí)間為1，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間的 RSD。采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版》軟件對樣品色譜圖進(jìn)行相似度評價(jià)。

2.4 方法學(xué)考察

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液(S1樣品)，分別于0，3，6，9，12 h時(shí)進(jìn)行檢測，以迷迭香酸峰(S峰)的保留時(shí)間為1，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果6個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的 RSD在0.05%～0.74%(n＝6)范圍內(nèi)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液(S1樣品)，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測定，以迷迭香酸峰(S峰)的保留時(shí)間為1。結(jié)果6個(gè)共有峰保留時(shí)間的 RSD在0.02%～1.31%（n＝6）范圍內(nèi)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批(S1樣品)樣品6份，按擬訂方法制備供試品溶液并進(jìn)行測定，以迷迭香酸峰(S峰)的保留時(shí)間為1，考察試驗(yàn)方法的重復(fù)性。結(jié)果6個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的 RSD在0.03%～0.28%（n＝6）范圍內(nèi)，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 特征圖譜的建立

2.5.1 特征圖譜采集

按2.3項(xiàng)下方法制備13批夏枯草配方顆粒供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。見圖1。

圖1 13批夏枯草配方顆粒樣品特征圖譜

2.5.2 共有峰標(biāo)定

采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版》軟件，自動匹配13批夏枯草配方顆粒HPLC圖譜所給出的相關(guān)參數(shù)，以平均數(shù)法生成對照特征圖譜（圖2）。匹配數(shù)據(jù)顯示，所有樣品HPLC圖譜共有6個(gè)共有峰，通過與對照品色譜圖比較，可知峰3為咖啡酸，峰4(S)為迷迭香酸。在特征圖譜中，以迷迭香酸峰(S峰)的保留時(shí)間為1，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間分別為 0.260，0.404，0.540，1.000，1.360，1.836。13批樣品HPLC圖譜中，以迷迭香酸峰為參照峰，積分參數(shù)斜率靈敏度為3、峰寬為0.04、最小峰面積為50，計(jì)算特征峰與參照峰的相對保留時(shí)間，結(jié)果均在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，見表2。

2.5.3 特征圖譜相似度評價(jià)

采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版》軟件，自動匹配13批夏枯草配方顆粒樣品HPLC圖譜的相關(guān)參數(shù)，通過“相似度計(jì)算”功能對樣品色譜圖進(jìn)行相似度評價(jià)。結(jié)果13批樣品的相似度在0.982～0.995范圍內(nèi)，說明13批樣品成分一致性較好。

圖2 夏枯草配方顆粒對照特征圖譜

表2 13批夏枯草配方顆粒樣品特征峰相對保留時(shí)間

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

考察了不同極性的溶劑(甲醇、80%甲醇、50%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇)對夏枯草配方顆粒的提取效果，結(jié)果80%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙醇提取的色譜特征峰數(shù)基本一致，70%乙醇溶液提取的吸收較強(qiáng)，故選擇70%乙醇作為提取溶劑。比較了超聲提取、水浴回流提取、振搖提取等不同提取方式，差異不大，考慮到操作的簡便性，因此采用超聲提取的方式。

3.2 流動相選擇

分別考察以甲醇－水、乙腈－水、甲醇－磷酸、乙腈－磷酸等為流動相進(jìn)行線性梯度洗脫，同時(shí)改變酸的濃度，結(jié)果在乙腈－0.1%磷酸系統(tǒng)下，色譜特征峰數(shù)目較多，分離效果較好。

3.3 檢測波長選擇

采用DAD檢測器在210，230，254，280，330 nm波長下分別進(jìn)行檢測，結(jié)果在210 nm波長下色譜峰數(shù)目最多，但基線漂移，而280 nm波長下吸收較強(qiáng)、色譜信息量較大，故選擇280 nm為檢測波長。

中藥配方顆粒已不具備中藥飲片的外形，中藥飲片所特有的“性狀”及“顯微鑒別”也不復(fù)存在，鑒別方法完全依賴于化學(xué)分析手段。目前，應(yīng)用于中藥配方顆粒鑒別的技術(shù)方法報(bào)道較少，主要有薄層色譜、傅里葉－紅外光譜及HPLC指紋圖譜等，其中以薄層色譜鑒別最常用[16]。特征圖譜的研究比指紋圖譜較簡單，但能很好地給中藥產(chǎn)品的定性鑒別提供準(zhǔn)確依據(jù)，其在中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面的應(yīng)用得到了國家藥典委員會的認(rèn)可和推崇。

本研究中建立了夏枯草配方顆粒的HPLC特征圖譜分析方法，從所得特征圖譜的分析結(jié)果來看，各批樣品的相似度高、均一性較好，各共有峰的相對保留時(shí)間較穩(wěn)定，具有專屬性。所建立的方法簡便、穩(wěn)定，重復(fù)性好，可作為夏枯草配方顆粒的鑒別依據(jù)，為采購、生產(chǎn)及其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

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Study on the HPLC Specific Chromatogram of Prunella Vulgaris Formula Granules

Hu Lian,Zhou Jie,Yuan Hui
(Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan,China 646000)

Objective To establish the HPLC specific chromatogram of Prunella Vulgaris Formula Granules.M ethods The specific chromatograms were analyzed by Welch Materials AQ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)and eluted with gradient acetonitrile and 0.1% phosphoric acid at a flow rate of 0.8 mL／min,detection wavelength of 280 nm,and sample volume of 10 μL.Results The specific chromatograms of Prunella Vulgaris Formula Granules were obtained.There were 6 characteristic peaks,and among them were 1 min identified by direct comparison with reference substances.The peak of rosmarinic acid is S peak.Calculate the relative retention time of each characteristic peaks and the S peak;the relative retention time should be 0.260(peak 1),0.404(peak 2),0.540(peak 3),1.000 (peak 4),1.360(peak 5),1.836(peak 6).Measure these 13 samples and the result was in accord with regulation.Conclusion The HPLC specific chromatograms is proved to be simple,stable and reproducible,and it can provide reference for the identification of Prunella Vulgaris Formula Granules.

Prunella vulgaris;formula granules;specific chromatograms;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2016)24－0016－04

胡蓮（1979－），女，大學(xué)本科，藥師，研究方向?yàn)橹形魉幝?lián)用和中西藥有效成分分析，（電子信箱）cchhh2003＠163.com。

2016－08－01)