真菌源幾丁質(zhì)酶在植物抗真菌病害中的應(yīng)用

程笑笑, 馮自力, 馮鴻杰, 趙麗紅, 師勇強(qiáng), 李志芳, 朱荷琴

(棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所, 安陽 455000)

真菌源幾丁質(zhì)酶在植物抗真菌病害中的應(yīng)用

程笑笑, 馮自力, 馮鴻杰, 趙麗紅, 師勇強(qiáng), 李志芳*, 朱荷琴*

(棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所, 安陽 455000)

幾丁質(zhì)酶可以降解大多數(shù)真菌細(xì)胞壁,阻止或中斷真菌在植物體內(nèi)的侵染、定殖和擴(kuò)展,在抗真菌病害的研究方面受到廣泛關(guān)注。本文綜述了真菌源幾丁質(zhì)酶的特性,對真菌的抑制作用機(jī)制,轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因植株的抗性評價(jià),產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株和相關(guān)制劑在生物防治方面的應(yīng)用,并對其在生產(chǎn)上的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

幾丁質(zhì)酶基因; 植物真菌病害; 抗病轉(zhuǎn)基因

幾丁質(zhì)在自然界中廣泛存在,又稱甲殼素,化學(xué)名稱為(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖,是由N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的含氮多糖類生物性高分子[1]。作為天然高分子,幾丁質(zhì)在地球上的蘊(yùn)藏量僅次于纖維素,位居第二位。其主要來源于甲殼類動(dòng)物的外殼、軟體動(dòng)物的器官、藻類和真菌細(xì)胞壁等等。真菌細(xì)胞壁的3%～60%是由幾丁質(zhì)構(gòu)成的[2],幾丁質(zhì)以微纖絲的形式錯(cuò)落包埋于其基質(zhì)中[3],可以被幾丁質(zhì)酶催化水解生成N-乙酰葡糖胺。

幾丁質(zhì)酶是幾丁質(zhì)生物降解過程中的關(guān)鍵酶,廣泛存在于各種生物中,并參與其中的多種生理生化過程[4-5]。幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)后產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)幾丁寡糖被廣泛應(yīng)用在農(nóng)、醫(yī)、化工、食品、環(huán)境保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域。真菌幾丁質(zhì)酶作為幾丁質(zhì)酶的重要成員,主要應(yīng)用于生物防治植物病害或轉(zhuǎn)基因抗性育種。從廣泛的真菌資源中克隆出新的幾丁質(zhì)酶基因,并研究其體外表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)性質(zhì)以及對真菌的抑制和抗病相關(guān)活性對于植物病害的生物防治和轉(zhuǎn)基因植物抗病的研究具有重要意義。

1 幾丁質(zhì)酶及其特性

1905年,Benecke首次報(bào)道了微生物溶幾丁質(zhì)芽胞桿菌Bacilluschitinourous能夠以幾丁質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì)[6],Karrer和Hofinann在蝸牛胃液中發(fā)現(xiàn)能水解幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶[7],隨后人們逐漸關(guān)注并研究微生物幾丁質(zhì)酶。

目前,發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物約有46個(gè)屬近70種,其中真菌有綠色木霉Trichodermaviride、哈茨木霉T.harzianum、淡紫擬青霉Paecilomyceslilacinus、枯草毛霉Mucorsubtilissimus、米曲霉Aspergillusoryzae、煙曲霉Aspergillusfumigatus、球孢白僵菌Beauveriabassiana、季也蒙假絲酵母Candidaguilliermondii、橄欖假絲酵母Candidaoleophila、疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyceslanuginosus等等,它們都是應(yīng)用廣泛的重要生防菌[[8-12]。

根據(jù)在底物上作用位置不同可以把幾丁質(zhì)酶分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和外切幾丁質(zhì)酶。其中內(nèi)切幾丁質(zhì)酶作用于同聚物內(nèi)部β-1,4-糖苷鍵,隨機(jī)剪切內(nèi)部的糖苷鍵,產(chǎn)生幾丁單糖和幾丁二糖等;外切幾丁質(zhì)酶則作用于同聚物線性末端β-1,4-糖苷鍵,剪切幾丁質(zhì)鏈的非還原末端,產(chǎn)生幾丁單糖。分析位于催化區(qū)的氨基酸序列,根據(jù)其氨基酸序列的同源性可以把幾丁質(zhì)酶分為18、19和20家族。18家族的幾丁質(zhì)酶大部分來源于細(xì)菌、真菌、病毒及少數(shù)植物。其中位于18家族β3和β4鏈上的兩段氨基酸序列是高度保守的,其催化區(qū)含有2個(gè)Asp和1個(gè)Glu,可能是活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸。18家族幾丁質(zhì)酶的水解產(chǎn)物為β異構(gòu)體[13]。19家族的幾丁質(zhì)酶大部分來源于植物和部分鏈霉菌屬真菌,水解產(chǎn)物是α異構(gòu)體。18家族和19家族的幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列沒有同源性。20家族的幾丁質(zhì)酶則基本上來源于鏈霉菌屬真菌與人類[14]。然而在最近幾年少數(shù)幾丁質(zhì)酶也被鑒定為屬于23家族和48家族[15]。

雖然不同來源幾丁質(zhì)酶之間的分子量差異比較大,但真菌源幾丁質(zhì)酶大都具有相似的結(jié)構(gòu)域。一般具有信號肽序列,幾丁質(zhì)酶催化域,幾丁質(zhì)結(jié)合域以及一個(gè)短的C端區(qū)域。催化域負(fù)責(zé)幾丁質(zhì)的水解,是幾丁質(zhì)酶主要功能區(qū),且高度保守,兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域分別為LISSGGW和DG-D-DWE[16],另外,在催化域還有6個(gè)Cys殘基參與了活性區(qū)的折疊。幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域主要負(fù)責(zé)與幾丁質(zhì)結(jié)合,使催化域更好地發(fā)揮水解作用。真菌幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)主要含有色氨酸殘基(W),與此不同的是,植物的該區(qū)域主要含有半胱氨酸殘基(C)[17]。目前還不太清楚幾丁質(zhì)酶C端區(qū)域的作用。有報(bào)道20個(gè)氨基酸在Altermonassp. strain O-7的C端序列形成一個(gè)疏水核,酶蛋白通過細(xì)胞膜時(shí)這個(gè)疏水核起著重要作用[18]。真菌和酵母的幾丁質(zhì)酶都還含有一個(gè)富含絲氨酸或蘇氨酸的區(qū)段,這個(gè)區(qū)段的作用可能也與酶的催化作用相關(guān)[19]。

阻遏物和誘導(dǎo)物能夠雙向調(diào)控真菌幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá),一些易被利用的碳源如葡萄糖常起到阻遏的作用,而起誘導(dǎo)作用的一般為幾丁質(zhì)或其降解產(chǎn)物。用純化的幾丁質(zhì)或植物病原真菌(如立枯絲核菌Rhizoctoniasolani和灰葡萄孢Botrytiscinerea)細(xì)胞壁作唯一碳源,可在離體條件下誘導(dǎo)木霉產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶;相反,纖維素、脫乙酰殼多糖不僅不能誘導(dǎo)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶,還會(huì)阻遏幾丁質(zhì)酶合成。海洋酵母Rhodosporidiumpaludigenum在常規(guī)培養(yǎng)條件下幾丁質(zhì)酶表達(dá)量少,但是經(jīng)由幾丁質(zhì)底物的誘導(dǎo),該酶的表達(dá)量大幅增加,生防效果顯著提高[20]。有研究者推測幾丁質(zhì)酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)可能與物理性接觸細(xì)胞表面不溶性底物有關(guān)。幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)也受到RNA合成抑制劑8-羥基喹啉和蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮的抑制,所以認(rèn)為幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)是從頭合成的,要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄翻譯的過程[21]。綠僵菌幾丁二糖酶的表達(dá)不受代謝抑制物的影響,它伴隨幾丁質(zhì)酶的表達(dá)而表達(dá),幾丁二糖酶降解N-乙酰葡萄糖胺后的產(chǎn)物N-乙酰氨基葡萄糖可作為幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)物。這可以解釋在幾丁質(zhì)酶活性低情況下為什么依然可以積累幾丁質(zhì)還原糖,這種調(diào)節(jié)模式的特殊之處在于它是通過一種酶的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對另一基因的調(diào)控。幾乎所有真菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶時(shí)都受到葡萄糖的抑制,真菌幾丁質(zhì)酶基因的調(diào)控涉及分解代謝物阻遏機(jī)制,而阻遏物和誘導(dǎo)物系統(tǒng)能夠防止幾丁質(zhì)酶的過量表達(dá)對微生物自身造成傷害[22]。

2 幾丁質(zhì)酶抑菌作用機(jī)制

在病原真菌中,幾丁質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要成分,其中子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌的細(xì)胞壁以幾丁質(zhì)和葡聚糖為主,接合菌的細(xì)胞壁則富含幾丁質(zhì)和聚氨基葡萄糖。幾丁質(zhì)酶作用于真菌的細(xì)胞壁后降解幾丁質(zhì)釋放出還原糖,充分證明了幾丁質(zhì)酶對真菌的抑制作用是發(fā)生在細(xì)胞壁上,通過破壞真菌細(xì)胞壁骨架,影響真菌形態(tài)建成、生長發(fā)育和致病力等[23]。

細(xì)胞壁是植物病原真菌進(jìn)入寄主植物并與之直接接觸的先鋒結(jié)構(gòu)[24],免疫化學(xué)技術(shù)直接證明了幾丁質(zhì)酶與真菌細(xì)胞壁間的作用[25]。Mitchell發(fā)現(xiàn)所有能裂解真菌細(xì)胞壁的細(xì)菌菌株都含有幾丁質(zhì)酶,這些細(xì)菌能在僅以幾丁質(zhì)作為碳源的培養(yǎng)基上正常生長,而細(xì)胞壁中無幾丁質(zhì)成分的真菌則不能被裂解[26]。幾丁質(zhì)酶除了對真菌細(xì)胞壁有明顯降解作用外,還可以抑制孢子萌發(fā)、菌絲生長、芽管伸長等發(fā)育活動(dòng)[27]。Toyoda等純化得到了來自灰霉素鏈霉菌Streptomycesgriseus的外源幾丁質(zhì)酶,分別用其處理離體和活體的大麥胚芽鞘,發(fā)現(xiàn)正在發(fā)育的大麥白粉菌Erysiphegraminisf.sp.hordei吸器完全消解,已經(jīng)發(fā)育成熟的病菌吸器的形狀雖未改變但菌絲的伸長和次生菌體的形成受到抑制[28]。Benhamou等觀察到木霉的幾丁質(zhì)酶可有效裂解齊整小核菌Sclerotiumrolfsii菌絲體,不僅能夠通過水解菌絲頂端生長區(qū)域新合成的幾丁質(zhì)破壞菌絲端部的生長,還可降解成熟的菌絲、分生孢子、厚垣孢子等含有幾丁質(zhì)的組織,從而抑制其生長[29-30]。

細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和電鏡技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)一步闡明了幾丁質(zhì)酶的抑菌機(jī)理。病原真菌細(xì)胞壁在幾丁質(zhì)酶的作用下發(fā)生扭曲、變形，之后出現(xiàn)菌絲細(xì)胞壁腫脹裂解,細(xì)胞質(zhì)聚集、原生質(zhì)體外溢或裸露等異?，F(xiàn)象,這些強(qiáng)烈的破壞作用使其不能正常生長[31]。因此,幾丁質(zhì)酶具有抑制植物病原菌生長繁殖的功能,可有效從源頭減弱或阻止其對寄主的侵染。

3 幾丁質(zhì)酶的生防應(yīng)用

與植物相比,微生物具有生長周期短、便于生產(chǎn)、易于研究的特點(diǎn),因此將真菌幾丁質(zhì)酶應(yīng)用于植物病原真菌的生物防治具備了良好的潛力。用對多種植物病原真菌有顯著抑制作用的鏈霉菌S01菌株外源表達(dá)的幾丁質(zhì)酶處理病原菌,病原菌菌絲產(chǎn)生了扭曲變形,細(xì)胞質(zhì)聚集、外溢的異常現(xiàn)象[32]。經(jīng)過基因工程改造的重組幾丁質(zhì)酶也具有良好的生防潛能,可有效抑制灰霉、根霉、毛霉和擬莖點(diǎn)霉的孢子萌發(fā),當(dāng)酶液濃度達(dá)到0.4%時(shí),抑制率可達(dá)91%以上[33]。粉紅聚端孢Trichotheciumroseum經(jīng)由SMCS誘導(dǎo)產(chǎn)生的胞外幾丁質(zhì)酶對煙草赤星病菌Alternariaalternata、串珠鐮刀菌Fusariummoniliforme、稻瘟病菌Magnaportheoryzae、棉花黃萎菌Verticilliumdahliae都有不同程度的抑制作用,其中對棉花黃萎菌的抑制作用最強(qiáng)[34]。鏈孢黏帚霉Gliocladiumcatenulatum分泌的幾丁質(zhì)酶除對小麥雪腐病、葡萄白腐病、玉米黃斑病及斑點(diǎn)落葉病等的病原菌孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用外,還能明顯抑制核盤菌Sclerotiniasclerotiorum和立枯絲核菌Rhizoctoniasolani的菌核萌發(fā),抑菌譜寬[35]。源自鏈孢黏帚霉HL-1-1菌株的幾丁質(zhì)酶Gc CHI1可以明顯抑制立枯絲核菌、油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum、番茄灰霉病菌Botrytiscinerea等多種植物病原真菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)和菌核萌發(fā)[36]。利用不同幾丁質(zhì)酶的協(xié)同作用,從理論上可獲得抑菌譜更廣泛、抑菌效果更加明顯的生防菌株。富集幾丁質(zhì)酶的鏈霉菌和芽胞桿菌菌株混合發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum、產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum、棉花枯萎病菌F.oxysporumf.sp.vasinfectum、小麥全蝕病菌Gaeumannomycesgraminis、綠色木霉T.viride、黃瓜黑星病菌Cladosporiumcucumerinum和啤酒酵母Saccharomycescerevisiae起到不同程度的抑制作用,也具有一定廣譜性[37]。

幾丁質(zhì)酶作為真菌細(xì)胞壁降解酶類的重要成員,是研究絲狀真菌和寄主植物相互作用的模式蛋白之一,具有良好的生防潛能,已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[38]。大部分產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的真菌可以直接或者間接抵御多種病原真菌對植物的侵染,體外表達(dá)的真菌源幾丁質(zhì)酶對真菌的生長也有抑制作用,且都具有較為廣泛的抑菌譜,生防功效良好。

4 轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因植物與抗病性

幾丁質(zhì)酶作為激發(fā)子可以直接啟動(dòng)植物防御反應(yīng),也可以通過其降解真菌細(xì)胞壁產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物(幾丁單糖和幾丁二糖等)誘導(dǎo)植物細(xì)胞做出系列防御反應(yīng),啟動(dòng)植物系統(tǒng)獲得抗性反應(yīng),使植物體內(nèi)病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related protein)含量升高,提高抗病防御酶類活性,產(chǎn)生抗菌代謝產(chǎn)物(植保素和芳香族化合物等);堅(jiān)固機(jī)械屏障,提高木質(zhì)化程度,從而減少或阻止病原菌的成功侵染和擴(kuò)散,提高植物抗病性[39-40]。

幾丁質(zhì)酶作為直接由基因編碼的抗菌蛋白,其基因是利用遺傳工程技術(shù)進(jìn)行抗病育種和提高生防菌對病原菌抑制作用的一個(gè)理想目標(biāo)基因。轉(zhuǎn)外源幾丁質(zhì)酶基因植物對某些病原的抗性增強(qiáng)。將植物源幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化到水稻、甜菜、大豆、馬鈴薯等受體植物中,獲得的轉(zhuǎn)基因植物不僅對真菌病害具有一定的抗性, 而且還對植物線蟲、昆蟲和其他一些病原物具有抗性[41]。鑒于不同幾丁質(zhì)酶作用位點(diǎn)的不同和催化區(qū)氨基酸排列多樣性，幾丁質(zhì)酶對底物呈現(xiàn)出不同的偏好性[12-13],與植物源和細(xì)菌源的幾丁質(zhì)酶相比,真菌幾丁質(zhì)酶對真菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的靶向性強(qiáng),其轉(zhuǎn)基因植物對靶標(biāo)真菌病害和非靶標(biāo)病害均呈現(xiàn)出高效而廣譜的抗性,同時(shí)通過誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得抗性而提高植物自身的抗病性,可以更好地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗病育種[42]。將深綠木霉T.atroviride的ech42基因?qū)氲綗煵莺婉R鈴薯中,轉(zhuǎn)基因植株高抗立枯絲核菌R.solani、鏈格孢Alternariaspp.和灰葡萄孢B.cinerea,抗性優(yōu)于細(xì)菌源或植物源幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因株系[43]。菌寄生真菌粉紅聚端孢幾丁質(zhì)酶基因trchi1作為優(yōu)質(zhì)抗性誘導(dǎo)基因被應(yīng)用于多種植物,轉(zhuǎn)trchi1基因煙草對煙草赤星病和炭疽病抗性顯著提升,轉(zhuǎn)trchi1基因水稻植株對立枯絲核菌達(dá)到高抗級別[42-44]。與其他幾丁質(zhì)酶相比,內(nèi)切幾丁質(zhì)酶具有更高的裂解活性和抗真菌活性[45],在主要通過合成內(nèi)切幾丁質(zhì)酶來提高植物抗病性的木霉中應(yīng)用較為頻繁。轉(zhuǎn)哈茨木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的蘋果增強(qiáng)了對蘋果瘡痂病的抗性[46]。在轉(zhuǎn)木霉幾丁質(zhì)酶ThEn-42基因煙草中,內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)顯著提高了受體植物對多種病原真菌的抗性,轉(zhuǎn)ThEn-42基因水稻對紋枯病的抗性級別也明顯提高[45-47]。轉(zhuǎn)木霉幾丁質(zhì)酶基因chit42的馬鈴薯中,內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的表達(dá)顯著提高了受體植物對番茄早疫病和紋枯病的抗性[48]。轉(zhuǎn)木霉幾丁質(zhì)酶基因的粳稻對水稻紋枯病和稻瘟病的抗性也得到了增強(qiáng)[49]。

除了將高活性的外源幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物體以構(gòu)建能表達(dá)高活力幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因植物,也有通過改造菌體如導(dǎo)入高效啟動(dòng)子以增加幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量。湯浩茹等構(gòu)建了pBin19ESR載體,其含煙草花葉病毒35S雙啟動(dòng)子和苜?；ㄈ~病毒引導(dǎo)序列控制下抗新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptⅡ)和哈茨木霉幾丁質(zhì)酶基因(ThEn-42),獲得的整合有ThEn-42基因的轉(zhuǎn)基因核桃的幾丁質(zhì)酶活性比對照高幾十至幾千倍[50]。轉(zhuǎn)基因植株抗性的提高程度與其所表達(dá)的幾丁質(zhì)酶活性也大都呈現(xiàn)正相關(guān)。轉(zhuǎn)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因ech42的蘋果對蘋果黑星病的抗性與內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性呈顯著正相關(guān)[51]。轉(zhuǎn)ThEn-42的粳稻品種,其內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性水平相比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼写蠓岣?也顯著增強(qiáng)了對稻瘟病和紋枯病的抵御能力[52]。編碼哈茨木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因Chi18-12的轉(zhuǎn)錄豐度比Chi18-5的轉(zhuǎn)錄豐度高,但是整體幾丁質(zhì)酶活性遠(yuǎn)高于Chi18-12,這兩種內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因在秀麗隱桿線蟲卵寄生過程中以協(xié)同增效的方式發(fā)揮著重要作用[53]。

共轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)酶基因、其他真菌細(xì)胞壁水解酶基因或者植物自身防衛(wèi)基因,獲得具備更強(qiáng)、更穩(wěn)定、更廣譜抗性的雙價(jià)或多價(jià)轉(zhuǎn)基因植株將會(huì)是未來的發(fā)展方向。Sharad等得到轉(zhuǎn)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因ech42和內(nèi)切葡聚糖酶基因bgn的番茄,與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?被番茄早疫病菌感染的葉面積極顯著降低,對齊整小核菌的防控效率高達(dá)83.4%,表現(xiàn)出了良好的抗性[54]。

理論上,似乎任何細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)的真菌都可被幾丁質(zhì)酶部分降解,但是研究發(fā)現(xiàn)來源不同的幾丁質(zhì)酶的抑菌作用具有選擇性:幾丁質(zhì)酶只對一部分真菌具有明顯的抑制作用而對另一些真菌則沒有抑制作用。真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異、幾丁質(zhì)所占比例的不同、幾丁質(zhì)暴露程度的差異、真菌體內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶調(diào)節(jié)因子的作用、外源基因的類型、不同的植物種類、基因的表達(dá)水平或其他因子的作用都有可能影響幾丁質(zhì)酶抑菌效果及選擇性,因此有必要對此再作深入研究,以擴(kuò)大幾丁質(zhì)酶抑菌譜[55]。

植物具有各種防御機(jī)制,以抵抗病原菌侵染。植物與病原菌互作的第一步為基于受體識別的微生物/病原相關(guān)分子模式(microbe/pathogen associated molecular patterns,MAMPs/PAMPs)激發(fā)的免疫反應(yīng),植物通過細(xì)胞表面受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別病原菌的PAMPs而啟動(dòng)植物的防衛(wèi)反應(yīng)[56-58]。幾丁質(zhì)或可溶性幾丁質(zhì)寡糖是潛在的MAMPs[59],幾丁寡糖被高度保守的模式識別受體(PRRs)和受體蛋白(RLPs)介導(dǎo)與植物受體結(jié)合。在水稻中第一個(gè)被報(bào)道響應(yīng)幾丁質(zhì)的免疫受體是幾丁質(zhì)激發(fā)子結(jié)合蛋白(OsCEBiP)[60],隨后,OsCEBiP的同源二聚體——幾丁質(zhì)激發(fā)子受體激酶(chitin elicitor receptor kinase)(OsCERK1)觸發(fā)Rac1鳥嘌呤核苷酸交換因子(OsRacGEF1)的磷酸化[61],通過小的 GTP酶Rac1激發(fā)MAPK級聯(lián)反應(yīng),啟動(dòng)活性氧迸發(fā),促進(jìn)防御酶類的積累,誘導(dǎo)抗性相關(guān)蛋白的表達(dá),從而使得植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性[62]。

雖然目前對防御機(jī)制相關(guān)研究取得了一定進(jìn)展,但是對胞外因子誘導(dǎo)免疫機(jī)制的理解仍不全面。如:病原真菌是如何感知和應(yīng)答植物被誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)？如何行使真菌源激發(fā)子的功能,并與植物病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein)互作,營造互贏的共處模式？植物病原真菌如何高效合理使用幾丁質(zhì)酶對抗異己、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞壁再生,同時(shí)又保護(hù)細(xì)胞壁完整性[24]？這些還有待于進(jìn)一步研究。

5 幾丁質(zhì)酶制品

幾丁質(zhì)酶作為對抗植物病原真菌的生物農(nóng)藥,也可作為農(nóng)藥增效劑與其他成分混配。如粘帚綠木霉幾丁質(zhì)酶和葡聚糖苷酶組合使用,或與生物性抗真菌物和化學(xué)殺真菌劑混用有增效抗菌作用。

許多研究者致力于篩選表達(dá)高活性幾丁質(zhì)酶的生防菌種,或應(yīng)用生物技術(shù)以改良菌種。例如,使可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的木霉菌Trichodermasp.與土壤優(yōu)勢植物病原菌的寄生菌T.hamatsuma融合,利用原生質(zhì)體融合技術(shù)使后者具生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力[63]。陳振明等曾通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法把來自綠色木霉的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的啟動(dòng)子和mRNA的編碼區(qū)與來自構(gòu)巢曲霉的色氨酸啟動(dòng)子相連,然后導(dǎo)入球殼毛殼菌CG10來改造生防菌[64]。將纖維素基因cbhl1啟動(dòng)子與深綠木霉幾丁質(zhì)酶基因ThEn-42融合后轉(zhuǎn)入本身無幾丁質(zhì)酶活性的里氏木霉RutC-30中,結(jié)果ThEn-42過度表達(dá),轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的活性酶產(chǎn)量為基因供體菌產(chǎn)量的20倍(猜測可能是由于缺乏負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制),達(dá)130 mg/L,可作為幾丁質(zhì)酶工業(yè)化生產(chǎn)用的菌種[65]。

由于幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分,而真菌生產(chǎn)條件相對簡單、周期短,因而成為生產(chǎn)幾丁質(zhì)潛在的新來源和研究熱點(diǎn)。目前已從多種真菌如:釀酒酵母、白色扁絲霉、構(gòu)巢曲霉、白僵菌、少孢根霉、哈茨木霉、玫煙色棒束孢等中分離出幾丁質(zhì)酶[66-69],并優(yōu)化了幾丁質(zhì)酶提取工藝,獲得可以直接應(yīng)用于生產(chǎn)的高產(chǎn)、高活性幾丁質(zhì)酶制劑[70]。

也有研究者提出利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)來分析或表達(dá)真核蛋白,一方面能使某些蛋白糖基化更加穩(wěn)定,另一方面也可將外源基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中,便于產(chǎn)品的分離純化[71]。此外,幾丁質(zhì)酶還可以有效用于制備真菌原生質(zhì)體。真菌原生質(zhì)體在研究酶的定位、超微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞壁的再生等方面有著非常重要的作用[72];并且還可以用于臨床真菌早期感染檢測,目前已經(jīng)提出了利用放射性標(biāo)記幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白來作為真菌感染的早期檢測方法[73]。

基因重組的微生物具有生產(chǎn)方便、靶標(biāo)菌不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn),因此今后應(yīng)篩選出產(chǎn)酶量高且適合工業(yè)化生產(chǎn)的基因工程菌及表達(dá)系統(tǒng),研究最佳發(fā)酵工藝,探索使酶活穩(wěn)定的方法,加工成適用劑型,從而推動(dòng)我國幾丁質(zhì)酶制劑的研究,使其更快、更好地為農(nóng)業(yè)服務(wù)。

6 問題與展望

幾丁質(zhì)酶研究已成為幾丁質(zhì)科學(xué)中的一個(gè)重要分支,尤其是其酶解產(chǎn)物對環(huán)境友好安全,預(yù)示著良好的應(yīng)用前景。目前,盡管有關(guān)真菌幾丁質(zhì)酶及其在植物真菌病害防治中的作用報(bào)道較多,但由于幾丁質(zhì)酶抑菌作用的選擇性,離生產(chǎn)上廣泛性應(yīng)用的要求還有一定距離。此外,常溫真菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶量少、穩(wěn)定性差,在田間的應(yīng)用受到限制。工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的安全性一直是人們十分關(guān)注的問題,還需要對轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因工程菌和轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行環(huán)境安全性評價(jià)。相信隨著發(fā)酵技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展,真菌源幾丁質(zhì)酶將在植物真菌病害生物防治中發(fā)揮更大的作用。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Applications of fungal chitinase in the fungal disease-resistant plants

Cheng Xiaoxiao, Feng Zili, Feng Hongjie, Zhao Lihong, Shi Yongqiang, Li Zhifang, Zhu Heqin

(State Key Laboratory of Cotton Biology/Institute of Cotton Research of Chinese Academy ofAgricultural Sciences, Anyang 455000, China)

Chitinase, which can degrade most fungal cell walls, prevent or interrupt the fungal infection, colonization and expansion in plants, has attracted a lot attention in fungi disease resistance. In this paper, we reviewed the characteristics of chitinase originated from fungi, the inhibition mechanism to fungi,the resistance evaluation of the transgenic plants, the application of chitinase-producing strains and related products in the biological control, and prospects for the development in the future.

chitinase gene; plant fungal disease; resistant transgenic plant

2016-07-05

2016-08-29

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201503109)

S 476.19

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.005

* 通信作者 E-mail：lizhifang2009@163.com；zhuheqin2012@163.com