利用重疊延伸PCR和同源重組克隆技術(shù)制備HLA- A*0201/HBc18-27單鏈三分子復(fù)合體

許濤，李曉娥，吳優(yōu)，Khawar Ali Shahzad，王偉，張雷，沈傳來

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009)

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利用重疊延伸PCR和同源重組克隆技術(shù)制備HLA- A*0201/HBc18-27單鏈三分子復(fù)合體

許濤，李曉娥，吳優(yōu)，Khawar Ali Shahzad，王偉，張雷，沈傳來

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009)

目的:構(gòu)建和表達(dá)HLA- A*0201/HBc18- 27單鏈三分子復(fù)合體。方法:利用重疊延伸PCR將HBc18- 27、(Gly4Ser)3、β2m、(Gly4Ser)4和HLA- A*0201胞外區(qū)依次串聯(lián)為單鏈三聚體(single- chain trimer，SCT)融合基因，通過同源重組克隆技術(shù)插入到pET28a原核表達(dá)載體，用異丙基β- D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，采用金屬螯合親和層析法純化目的蛋白，通過稀釋復(fù)性法折疊成HLA- A*0201/HBc18- 27的復(fù)合單體，并生物素化，將單體包被到直徑4.5μm的磁性微球，用構(gòu)象特異性單抗(W6/32)進(jìn)行熒光染色，流式細(xì)胞術(shù)分析其空間構(gòu)象。結(jié)果:pET28a- HLA- A*0201/HBc18- 27基因序列和蛋白大小與預(yù)測(cè)一致；純化后融合蛋白純度約93%；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示pET28a- HLA- A*0201/HBc18- 27單體具有正確的空間構(gòu)象。結(jié)論:利用重疊延伸PCR和同源重組克隆技術(shù)成功制備了HLA- A*0201/HBc18- 27的單鏈復(fù)合體，無需限制性內(nèi)切酶和連接酶，發(fā)展了主要組織相容性單鏈復(fù)合體技術(shù)，有效簡化了pMHC Ⅰ類分子的制備過程。

重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 同源重組；主要組織相容性復(fù)合體

MHC Ⅰ- 肽(major histocompatibility complex class I/peptide，pMHC)四聚體技術(shù)是目前檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)，最具準(zhǔn)確性和特異性[1]。傳統(tǒng)pMHC制備方法步驟繁瑣、耗時(shí)長、復(fù)性產(chǎn)量低、需要合成抗原肽等，阻礙了四聚體技術(shù)的推廣和應(yīng)用[2]。2002年Yu等[3]將抗原肽、β2m和MHC Ⅰ類分子以2個(gè)柔性接頭依次串聯(lián)融合成一條肽鏈，稱之為單鏈三聚體(single- chain trimer，SCT)。該技術(shù)省去了重鏈和β2m蛋白體外折疊、合成抗原肽等步驟，簡化了制備流程，是對(duì)pMHC制備技術(shù)的重要改進(jìn)。但SCT基因的克隆需要將5條不同基因片段連接在一起，其中的抗原肽和MHC I類分子的α鏈種類繁多，需要不同的限制性內(nèi)切酶和連接酶，因此限制了很多特定pMHC融合基因的克隆表達(dá)。重疊延伸PCR(overlap extension PCR)可以將兩條或者多條不同基因片段重疊拼接在一起，形成一條基因片段，不需限制性內(nèi)切酶和連接酶等處理[4]。同源重組克隆技術(shù)是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)，可將插入片段PCR產(chǎn)物通過同源重組的原理定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)，無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點(diǎn)，不依賴于連接酶及磷酸酶，克隆陽性率可達(dá)95%以上[5]。本研究首次將該兩項(xiàng)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于pMHC單鏈三聚體的構(gòu)建，有效發(fā)展了pMHC SCT技術(shù)。

乙肝病毒核心蛋白第18- 27位氨基酸殘基FLPSDFFPSV(HBc18- 27)是HLA- A*0201限制性的抗原表位肽，與HLA- A*0201具有高親和力[6]。本研究利用重疊延伸PCR將HBc18- 27、(Gly4Ser)3、β2m、(Gly4Ser)4和HLA- A*0201(α1/α2/α3)依次串聯(lián)為HLA- A*0201/HBc18- 27SCT基因，通過同源重組克隆技術(shù)插入pET28a原核表達(dá)載體，然后在BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)、鎳柱純化、稀釋復(fù)性和生物素化等，成功制備HLA- A*0201/HBc18- 27復(fù)合單體，經(jīng)構(gòu)象特異性單抗的熒光染色驗(yàn)證具有正確的空間構(gòu)象。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α，載體pET- 28a、pET28- β2m和pET28- HLA- A*0201為本單位實(shí)驗(yàn)室保存。高保真DNA聚合酶、ClonExpress一步法克隆試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Ni- Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；BirA酶購自美國Avidity公司；鏈酶親和素購自上海生工生物工程有限公司；4.5μm磁性微球購自Invitrogen公司；PE- Anti- Human HLA- ABC(W6/32)單克隆抗體購自eBioscience公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)重疊延伸PCR技術(shù)和ClonExpressTM同源重組克隆技術(shù)的原理，參照文獻(xiàn)[3，7]設(shè)計(jì)HLA- A*0201/HBc18- 27SCT重組質(zhì)粒構(gòu)建中所需要的PCR引物，如表1所示。所有引物均由上海桑尼生物科技公司合成。

1.3 HLA- A*0201/HBc18- 27SCT融合基因的構(gòu)建

如圖1所示，首先以pET28- β2m為模板，先后用引物對(duì)HF1/HR1和HF2/HR1進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增，獲得HBc18- 27- (Gly4Ser)3- β2m融合基因；然后以pET28- HLA- A*0201為模板，先后用引物對(duì)HF3/HR2和HF4/HR2進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增，獲得β2m94- 99- (Gly4Ser)4- HLA- A*0201(α1/α2/α3)- AviTag；最后用引物對(duì)HF2/HR2進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，以上述PCR產(chǎn)物為模板，將上述兩個(gè)融合基因片段通過β2m的重疊序列連接起來，獲得HBc18- 27- (Gly4Ser)3- β2m- (Gly4Ser)4- HLA- A*0201(α1/α2/α3)- AviTag融合基因。

表1 構(gòu)建HLA- A*0201/HBc18- 27SCT重組質(zhì)粒所用的PCR引物

Tab 1 Primers used in construction of HLA- A*0201/HBc18- 27SCT

引 物序列(5'-3') 引物對(duì)及目的基因片段 HF1GGAGGTGGCGCTTCAGGAGGTGGCGGTTCAGGAGGTGGCGGTTCAGATATCCAGCGTACTCCAAAGATTHF1/HR1:(G4S)3-β2m(342bp)HF2TTTTTACCTTCTGATTTCTTTCCTTCGGTCGGAGGTG-GCGCTTCAHF2/HR1:HF3GGAGGTGGCGGTTCAGGAGGTGGCGGTTCAGGAGGTGGCGGTTCAGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCCCACTCCATGAGGTAHBc18-27-(G4S)3-β2m(372bp)HF4AAGTGGGATCGAGACATGGGAGGTGGCGGTTCAGGAGGTGGCGGTTCAGGAGGTGGCGGTTCAGGAGGTGGCGGTTCAGGHF3/HR2:(G4S)4-HLA-A*0201-AviTag(915bp)HR1CATGTCTCGATCCCACTTHF4/HR2:HR2CTCATGCCATTCAATTTTCTGTGCT-TCGAAAATATCATTCAAGCCGCCCCCGGTGAGGGGCTTGGGCAGACβ2m94-99-(G4S)4-HLA-A*0201-AviTag(933bp)HFGAAGGAGATATACCATGTTTTTACCTTCTGATHF2/HR2:HRGTGGTGGTGGTGGTGCTCATGCCATTCAATHLA-A*0201/HBc18-27(1287bp)

圖1 重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建HLA- A*0201/HBc18- 27SCT融合基因

Fig 1 Schematic representation of overlap- extension PCR for the splicing of HLA- A*0201/HBc18- 27single- chain fusion gene

1.4 pET28a- HLA- A*0201/HBc18- 27表達(dá)載體的構(gòu)建

如圖2所示，利用同源重組技術(shù)將HLA- A*0201/HBc18- 27基因插入pET28a載體，同源重組酶復(fù)合物由RecE/Redα、RecT/Redβ和Recγ蛋白組成。首先，RecE/Redα結(jié)合到雙鏈DNA片段，從5′- 3′端降解DNA，產(chǎn)生3′突出端；然后，RecT/Redβ蛋白結(jié)合到單鏈DNA上，介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA退火；Redγ蛋白可與細(xì)菌RecBCD酶結(jié)合，抑制其降解外源線性DNA的活性[8]。

圖2 同源重組克隆技術(shù)構(gòu)建pET28a- HLA- A*0201/HBc18- 27表達(dá)載體

Fig 2 Schematic representation of homologous recombination cloning technique for the construction of recombinant plasmid pET28a- HLA- A*0201/HBc18- 27

分別以HLA- A*0201/HBc18- 27基因和pET28a載體為模板，以引物對(duì)HF/HR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得線性化HLA- A*0201/HBc18- 27基因和pET28a。其中引物HF包括17nts pET28a載體5′端堿基序列和15nts HLA- A*0201/HBc18- 27基因5′端堿基序列，引物HR包括15nts pET28a載體3′端堿基序列和15nts HLA- A*0201/HBc18- 27基因3′端堿基序列。體外重組反應(yīng)體系50 μl，HLA- A*0201/HBc18- 27基因60 μg，線性化pET28a 100 μg，5×CE II buffer 4 μl，ExnaseTMII 2 μl。于37℃反應(yīng)30 min，立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻5 min。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，重組載體羧基端編碼生物素化蛋白和組氨酸His6標(biāo)簽蛋白。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，將陽性菌株送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，選擇測(cè)序正確的陽性菌株提取重組質(zhì)粒。

1.5 HLA- A*0201/HBc18- 27單鏈重組蛋白的表達(dá)與純化

將重組pET28a- HLA- A*0201/HBc18- 27質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)中，接種于含50μg·ml-1氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，再以1∶100接種于500 ml含50μg·ml-1氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí)加入IPTG(0.1 mmol·L-1)，37℃ 誘導(dǎo)6 h，于4℃ 6000 r·min-1離心20 min，收集菌體，用細(xì)菌裂解液(20 mmol·L-1Tris- HCl，5 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1PMSF，1 mg·L-1Lysozyme，20 mg·L-1DNAase I，10 mmol·L-1MgCl2，pH 8.0)重懸菌體，冰浴超聲波破碎，再于4℃ 6000 r·min-1離心20 min，分別收集上清和沉淀，將沉淀溶于包涵體溶解液(20 mmol·L-1Tris- HCl，500 mmol·L-1NaCl，8 M urea，pH 7.9)。取5 ml Ni- Agarose His膠與10 ml包涵體溶液，加入層析柱中，輕輕混勻，用15倍柱體積的包涵體溶解液沖洗柱子，洗去未結(jié)合雜蛋白，然后分別用含25、50、250、500 mmol·L-1咪唑的包涵體溶解液洗脫，分段收集洗脫液，用12% SDS- PAGE分析洗脫產(chǎn)物，BCA蛋白定量，-80℃保存。

1.6 HLA- A*0201/HBc18- 27復(fù)合物單體的復(fù)性折疊

參考King等[9]文獻(xiàn)的稀釋復(fù)性法，在400 ml折疊緩沖液(100 mmol·L-1Tris- HCl，400 mmol·L-1L- arginine，2 mmol·L-1EDTA，5 mmol·L-1Reduced glutathione，0.5 mmol·L-1Oxidised glutathione，0.1 mmol·L-1PMSF，1μg·ml-1Pepstatin，1μg·ml-1Leupeptin，pH 8.0)中，將20 mg HLA- A*0201/HBc18- 27包涵體蛋白分5次(每次4 mg)緩慢注射加入，每次間隔8～12 h，置4℃緩慢攪拌，48～72 h后超濾濃縮、透析，參照BirA酶使用說明書對(duì)折疊后的HLA- A*0201/HBc18- 27復(fù)合體進(jìn)行生物素化，超濾去除游離生物素，用BCA法蛋白定量，分裝后于-80℃保存。

1.7 HLA- A*0201/HBc18- 27復(fù)合物單體構(gòu)象的鑒定

取直徑4.5 μm磁性微球2×105管-1，PBS洗滌3次， 加入2.5 μg鏈酶親和素，4℃過夜孵育；30% BSA- PBS室溫封閉磁珠4 h，在磁場(chǎng)下用PBS洗滌3次； 加入10 μg生物素化HLA- A*0201/HBc18- 27復(fù)合單體，4℃孵育過夜，在磁場(chǎng)下用PBS洗滌3次，以BSA封閉組為空白對(duì)照，微球加鏈霉親和素但不加HLA- A*0201/HBc18- 27復(fù)合體為陰性對(duì)照組；加入5 μl PE- Anti- Human HLA- ABC(W6/32)單克隆抗體，4℃避光孵育1 h，在磁場(chǎng)下用PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)微球表面的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 HLA- A*0201/HBc18- 27SCT融合基因的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖3A結(jié)果顯示，以pET28- β2m為模板，先后用引物對(duì)HF1/HR1和HF2/HR1進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物分別為342bp(Lane 1)和372bp(Lane 2)；以pET28- HLA- A*0201為模板，用HF3/HR2和HF4/HR2引物對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物分別為915bp(Lane 3)和933bp(Lane 4)；以HBc18- 27- (G4S)3- β2m和β2m94- 99- (G4S)4- HLA- A*0201- AviTag為模板，用引物HF2/HR3進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物大小1287bp(Lane 5)，上述擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)測(cè)一致。菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖3B)顯示，在1500bp左右附近有目的片段的出現(xiàn)，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致；重組質(zhì)粒經(jīng)上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序分析，目標(biāo)重組基因序列準(zhǔn)確無誤。

2.2 HLA- A*0201/HBc18- 27單鏈重組蛋白的表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒HLA- A*0201/HBc18- 27轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、超聲波破碎、離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行12% SDS- PAGE分析，結(jié)果見圖4。在大約48 kD處出現(xiàn)與目的蛋白大小一致的蛋白條帶，且大部分在沉淀中，表明表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。圖5顯示了包涵體蛋白經(jīng)鎳離子層析柱純化的結(jié)果：流穿液中目的蛋白很少(泳道 2)，表明目的蛋白已結(jié)合到鎳柱上；含0、25、50 mmol·L-1咪唑洗滌緩沖液洗脫的主要為非目的蛋白(泳道 3～5)；經(jīng)250和500 mmol·L-1咪唑的洗滌緩沖液洗脫的為目的蛋白(泳道 6～9)，且條帶單一，濃度較高，電泳光密度掃描結(jié)果顯示蛋白純度為93%，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

M. DNA Marker；1. (G4S)3- β2m(342bp)；2. HBc18- 27- (G4S)3- β2m(372bp)；3. (G4S)4- HLA- A*0201- AviTag(915bp)；4. β2m94- 99- (G4S)4- HLA- A*0201- AviTag(933bp)；5. HLA- A*0201/HBc18- 27(1 287bp)

M. DNA Marker；1. 1號(hào)克隆；2. 2號(hào)克隆

A.HLA- A*0201/HBc18- 27重疊延伸PCR產(chǎn)物；B.菌落PCR產(chǎn)物

圖3 HLA- A*0201/HBc18- 27重疊延伸PCR和菌落PCR產(chǎn)物

Fig 3 Electrophoresis analyses of overlap- extension PCR and colony PCR products

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 細(xì)菌總蛋白；2. 細(xì)菌培養(yǎng)上清；3. 細(xì)菌沉淀

圖4 HLA- A*0201/HBc18- 27融合蛋白在BL21(DE3)中的表達(dá)
Fig 4 HLA- A*0201/HBc18- 27single- chain protein was expressed in E.coli BL21(DE3)

2.3 HLA- A*0201/HBc18- 27復(fù)合體構(gòu)象鑒定

本實(shí)驗(yàn)中所用磁性微球表面布滿環(huán)氧化基團(tuán)，可以迅速將蛋白共價(jià)偶聯(lián)到微球表面。先將鏈霉親和素包被到磁性微球表面，BSA封閉多余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)后再將生物素化的HLA- A*0201/HBc18- 27單體與微球孵育。在微球表面，一個(gè)鏈霉親和素分子可能結(jié)合1- 4個(gè)生物素化的HLA- A*0201/HBc18- 27單體。W6/32是一種特異性針對(duì)HLA Ⅰ類分子重鏈與β2m非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合體構(gòu)象的單克隆抗體，不與單獨(dú)的輕鏈或重鏈結(jié)合[9]。磁性微球大小為4.5 μm，與細(xì)胞大小相當(dāng)，可以通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)W6/32熒光單抗與磁珠表面HLA- A*0201/HBc18- 27復(fù)合體的結(jié)合強(qiáng)度，以驗(yàn)證其是否折疊成正確的MHC I類分子空間構(gòu)象。

結(jié)果如圖6所示，HLA- A*0201/HBc18- 27復(fù)合體與包被鏈霉親和素的磁性微球結(jié)合后能展示其正確的空間構(gòu)象，從而與能熒光標(biāo)記的MHC I類分子構(gòu)象特異性抗體W6/32有效結(jié)合，染色陽性率為96.97%，平均熒光強(qiáng)度為26.69，而空白對(duì)照微球(0.20%)及陰性對(duì)照微球(0.15%)的平均熒光強(qiáng)度為6.47和6.39，差異明顯。

M. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1. 純化前；2. 流穿液；3～9. 0、25、50、250、250、250、500 mmol·L-1洗脫液

圖5 鎳柱純化HLA- A*0201/HBc18- 27包涵體蛋白

Fig 5 Inclusion body was purified by passing through the Ni+- chelating affinity column of Ni+- NTA agarose resin

3 討 論

SCT復(fù)合物的3個(gè)組分是通過共價(jià)鍵連在一起，即使抗原肽從MHCⅠ類分子的抗原結(jié)合槽中脫落，仍可重新折疊形成正確的構(gòu)象。因此，SCT中共價(jià)結(jié)合的抗原肽與MHCⅠ類分子的親和力比傳統(tǒng)四聚體技術(shù)中的抗原肽強(qiáng)數(shù)倍[3]。但是，傳統(tǒng)構(gòu)建SCT表達(dá)載體的方法，需要先分別擴(kuò)增獲得抗原肽、β2m輕鏈和重鏈的基因，然后再進(jìn)行酶切、連接、酶切、連接等步驟，最后通過特定的酶切位點(diǎn)重組克隆到擁有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒載體中[7]。其中的抗原肽和MHC Ⅰ類分子的α鏈種類繁多，需要不同的限制性內(nèi)切酶，因此限制了很多特定pMHC融合基因的克隆表達(dá)[10]。以常用的高效原核表達(dá)載體pET28a為例，該載體轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG位于限制性內(nèi)切酶NcoⅠ(CCATGG)內(nèi)，因此，插入目的基因的起始核苷酸位點(diǎn)必須為G，而起始核苷酸位點(diǎn)為A、T和C的目的基因則不能正確插入pET28a載體中，需要更換限制性內(nèi)切酶或表達(dá)載體[11]。近年來，一種基于λ噬菌體Red操縱子的同源重組克隆技術(shù)廣泛應(yīng)用于DNA定向克隆[8]。該技術(shù)可將目的基因片段定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)，不需要特定限制性內(nèi)切酶和連接酶，有效地避免了在克隆過程中遇到的合適內(nèi)切酶的選擇、磷酸化、補(bǔ)平、加A以及使用中間載體等的一系列復(fù)雜步驟。

圖6 HLA- A*0201/HBc18- 27單體與W6/32單抗的有效結(jié)合

Fig 6 HLA- A*0201/HBc18- 27SCT binds effectively with W6/32 mAb

為此，本實(shí)驗(yàn)首次通過重疊延伸PCR將HBc18- 27、(GS4)3、β2m、(GS4)4和HLA- A*0201(α1/α2/α3)依次串聯(lián)為HLA- A*0201/HBc18- 27SCT基因，在聯(lián)合同源重組克隆技術(shù)將其插入pET28a原核載體，成功構(gòu)建和表達(dá)了pET28a- HLA- A*0201/HBc18- 27單鏈三分子復(fù)合體，且不需要任何限制性內(nèi)切酶和連接酶，發(fā)展了pMHC SCT制備技術(shù)，有效簡化了pMHC復(fù)合體的制備步驟，為以后制備四聚體及其他多聚體提供了新的制備方法。

[1] DOHERTY P C.The numbers game for virus- specific CD8+T cells[J].Science,1998，280(5361):227．

[2] SHEN C，HE Y，MENG F，et al.Characterization of MHC/peptide complexes refolded by a one- step ion- exchange chromatography[J].J Immunol Methods，2011，369：81- 90．

[3] YU Y Y，NETUSCHIL N，LYBARGER L，et al.Cutting edge：Single- chain trimers of MHC class I moleculesform stable structures that potently stimulate antigen- specific T cells and B cells[J].J Immunol，2002，168:3145- 3149．

[4] HECKMAN K L，PEASE L R.Gene splicing and mutagenesis by PCR- driven overlap extension[J].Nat Protoc，2007，2(4):924- 932．

[5] JACOBUS A P，GROSS J.Optimal cloning of PCR fragments by homologous recombination inEscherichiacoli[J].PLoS One，2015，10(3):e0119221.

[6] CHEN X，TANG Y，ZHANG Y，et al.Tapasin modification on the intracellular epitope HBcAg18- 27enhances HBV- specific CTL immune response and inhibits hepatitis B virus replicationinvivo[J].Lab Invest，2014，94(5):478- 490．

[7] HANSEN T，YU Y Y，F(xiàn)REMONT D H.Current Protocols in Immunology[M].New Jersey:John Wiley & Sons，Inc.2009:17.5.1- 17.5.17．

[8] REDDY T R，F(xiàn)EVAT L M，MUNSON S E，et al.Lambda red mediated gap repair utilizes a novel replicative intermediate inEscherichiacoli[J].PLoS One，2015，10(3):e0120681.

[9] KING B C，HAMBLIN A D，SAVAGE P M，et al.Antibody- peptide- MHC fusion conjugates target non- cognate T cells to kill tumour cells[J].Cancer Immunol Immunother，2013，62(6):1093- 1105．

[10] 黃慶海，吳亞萌，李震，等.基于HLA等位基因頻率的全球人群親緣關(guān)系初探[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，33(4)：429- 435．

[11] 孟凡巖，沈傳來，郭薇，等.利用CEA694- 702- β2m融合蛋白制備HLA- CEA694- 702復(fù)合體[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，28(5)：366- 370．

Preparation of HLA- A*0201/HBc18- 27single- chain trimer with overlap extension PCR and homologous recombination techniques

XU Tao，LI Xiao- e，WU You，KHAWAR Ali Shahzad，WANG Wei，ZHANG Lei，SHEN Chuan- lai

(DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology，MedicalSchool，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To construct and express the single- chain trimer(SCT) gene of HLA- A*0201/HBc18- 27complex. Methods: The SCT gene of HBc18- 27peptide- (G4S)3- β2m- (G4S)4- HLA- A*0201(α1，α2，α3) was constructed and inserted into plasmid pET28a with overlap extension PCR and homologous recombination techniques.The SCT protein of HLA- A*0201/HBc18- 27was expressed by the addition of IPTG inEscherichiacoliBL21(DE3)，then purified by passing through a Ni+- chelating affinity column.Soluble inclusion bodies were refolded by dilution refolding method using the redox- shuffling refolding buffers.The refolded SCT protein was biotinylated，and then coupled onto the cell- sized magnetic beads(4.5 μm) which pre- coated with streptavidin.PE- labeled anti- Human HLA- ABC mAb(W6/32) was used as a probe to monitor the structural conformations of HLA- A*0201/HBc18- 27molecule by flow cytometric analyses. Results: The recombinant plasmid of pET28a- HLA- A*0201/HBc18- 27was confirmed by nucleotide sequencing and SDS- PAGE analysis.The fractions containing HLA- A*0201/HBc18- 27protein was eluted using elution buffer(250 mmol·L-1imidazole) with a purity of about 93% as estimated by densitometry analysis of SDS- PAGE.The strong binding of mAb W6/32 with HLA- A*0201/HBc18- 27SCT- coated magnetic beads implied the correct structural conformation of the SCT molecules. Conclusion: The overlap extension PCR and homologous recombination technique simplifies the construction of single- chain MHC class I molecules bypass the requirement of restriction sites，and will facilitate the preparation of soluble MHC class I/peptide complexes．[Key words] overlap- extension polymerase chain reaction; homologous recombination; major histocompatibility complex

2016- 05- 13

2016- 06- 20

江蘇省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2012739)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81172823；81372448)

許濤(1985-)，男，滿族，山東菏澤人，在讀博士研究生。E- mail:nxtaoxu@163.com

沈傳來 E- mail:chuanlaishen@seu.edu.cn

許濤，李曉娥，吳優(yōu)，等.利用重疊延伸PCR和同源重組克隆技術(shù)制備HLA- A錯(cuò)誤的標(biāo)簽：span.emphasis_subscript0201/HBc18- 27單鏈三分子復(fù)合體[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(6)：825- 831.

Q784

A

1671- 6264(2016)06- 0825- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06．001