分子診斷技術(shù)在傳染病病原體檢測(cè)中的具體應(yīng)用分析

池曉峰

內(nèi)蒙古赤峰市松山醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰024000

分子診斷技術(shù)在傳染病病原體檢測(cè)中的具體應(yīng)用分析

池曉峰

內(nèi)蒙古赤峰市松山醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰024000

傳染病能夠得到有效防控的條件和前提就是傳染病病原體的準(zhǔn)確檢測(cè)，同時(shí)傳染病病原體的準(zhǔn)確檢測(cè)也是科學(xué)給藥的基礎(chǔ)。但是，原有的病原體分離和培養(yǎng)等方法無(wú)法滿足防控疾病和臨床診療的需求。分析診斷技術(shù)在傳染病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用彌補(bǔ)了這方面的空白。該文對(duì)新一代的分子診斷技術(shù)在傳染病病原體檢測(cè)中的具體應(yīng)用進(jìn)行探討和分析，以期為此領(lǐng)域的廣大醫(yī)療工作者提供一些有價(jià)值的參考和依據(jù)。

高通量核苷酸測(cè)序；基因增擴(kuò)；微點(diǎn)陣分析；分子診斷技術(shù)；傳染??；生物傳感技術(shù)

傳染病是全世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)疾病和多發(fā)疾病，發(fā)病原因復(fù)雜、傳播速度極快。目前，我國(guó)乃至全世界的傳染病傳播呈現(xiàn)不斷擴(kuò)大的上升趨勢(shì)，傳染病的變異和更新周期逐漸縮短，患者的癥狀逐漸加重，給患有傳染性疾病的全世界患者的健康帶來(lái)了極大的威脅，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命質(zhì)量。傳染性疾病的爆發(fā)已經(jīng)引起了全世界醫(yī)學(xué)專家的廣泛關(guān)注，已經(jīng)成為了世界公共衛(wèi)生問(wèn)題。傳染性疾病的病原體較多，傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)手段復(fù)雜、精確度較低等弊端，延長(zhǎng)了傳染病病原體的檢測(cè)周期，極不利于傳染性疾病病原體的確診和治療。分子診斷技術(shù)的引進(jìn)，對(duì)傳染病病原體檢測(cè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值和實(shí)踐意義，分子診斷技術(shù)采用先進(jìn)的新一代測(cè)序技術(shù)和生物芯片技術(shù)，對(duì)傳染病病原體進(jìn)行檢測(cè)，其具有確診時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)。分子診斷技術(shù)在傳染病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用，將會(huì)是未來(lái)傳染病病原體檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)。

1 新一代測(cè)序技術(shù)

1.1 病原體培養(yǎng)物樣本的基因組測(cè)序

對(duì)于病原體的確證方法，最精密、最準(zhǔn)確的方法就是取得病原體的所有基因。通過(guò)核酸的提煉、文庫(kù)的建立和定量的質(zhì)控，從感染病例當(dāng)中分離出病原體，利用新一代的測(cè)序技術(shù)獲取病原體基因，進(jìn)而對(duì)病原體進(jìn)行精密而準(zhǔn)確的認(rèn)定，發(fā)現(xiàn)基因標(biāo)志物用于檢驗(yàn)試劑的研發(fā)，能夠有助于快速突破疾病的致病反應(yīng)。病原體基因組還有另外一個(gè)作用，就是通過(guò)溯源分析以及耐藥分析，可以透徹深入分析疫情的傳播機(jī)制[1]。

1.2 非培養(yǎng)樣本病原體的檢測(cè)

非培養(yǎng)樣本病原體的檢測(cè)可以通過(guò)新一代的測(cè)序技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)。新一代的測(cè)序技術(shù)不想傳統(tǒng)技術(shù)需要對(duì)于病原體進(jìn)行假設(shè)，相反，沒(méi)有對(duì)于病原體的預(yù)先假設(shè)，極為符合檢測(cè)非培養(yǎng)樣本病原體當(dāng)中的“未知”病原體，這種檢測(cè)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)其他檢測(cè)手法無(wú)法達(dá)到的檢測(cè)目的，能夠解決其他方法無(wú)法解決的難題[2]。但是，非培養(yǎng)樣本病原體中，正常的菌群和宿主是其主要的核算背景，病原體的信噪比極低，因此，擁有極大的難度。原因在于病原體必須依靠?jī)?yōu)秀的生物技術(shù)和領(lǐng)先的樣本處理手段，才能得以實(shí)現(xiàn)對(duì)于非培養(yǎng)樣本病原體的檢測(cè)，這種檢測(cè)手段的實(shí)施非常具有挑戰(zhàn)性。

2 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)指的是利用微加工手段，建立微信系統(tǒng)在面積為一平方厘米的物體上，這個(gè)物體是一種固體或是液體的表面，利用特異性分子之間的作用的原理，進(jìn)行分子自動(dòng)檢測(cè)[3]。分子是核酸、蛋白質(zhì)等，檢驗(yàn)的屬性是快速的、精確的、平行的和高通量的。生物芯片包括蛋白質(zhì)芯片、基因芯片以及芯片試驗(yàn)室。當(dāng)前，生物芯片技術(shù)產(chǎn)品已經(jīng)廣泛引用于臨床試驗(yàn)中，并且應(yīng)用領(lǐng)域涉及到基因分型和耐藥監(jiān)測(cè)領(lǐng)域、微生物感染鑒別領(lǐng)域等。

2.1 病原微生物感染鑒別診斷

病原微生物種類繁多，在實(shí)際的臨床和實(shí)踐診治當(dāng)中，對(duì)于病原微生物感染鑒別診斷具有巨大的需求[4]。生物芯片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是高通量，能夠在同一時(shí)間對(duì)許多標(biāo)志物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)于各種病原體進(jìn)行篩查，當(dāng)前，多個(gè)此類產(chǎn)品已經(jīng)面世。

2.2 病原微生物基因分型

疾病的生產(chǎn)和疾病預(yù)后的不同發(fā)展，是由于用一種類的病原微生物具有不同的基因型。所以，采用生物芯片技術(shù)針對(duì)核酸特異性序列進(jìn)行基因分型非常有必要，這項(xiàng)基因分型技術(shù)具有重要的作用。比如利用生物芯片方法，HBV基因分型檢驗(yàn)試驗(yàn)盒，能夠劃分出8個(gè)基因型，應(yīng)用血漿樣本以及血清樣本當(dāng)中的HBV的檢驗(yàn)[5]。雖然基因分型中的分子測(cè)序是黃金圭臬。在測(cè)序技術(shù)和基因芯片技術(shù)的比較當(dāng)中，基因芯片技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度極高，比如在針對(duì)一些微生物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于含量非常低，利用原始標(biāo)本檢測(cè)難度較大，因?yàn)殡y以滿足測(cè)序的基因要求，但是利用基因芯片技術(shù)就可以完成這種檢測(cè)，將信號(hào)擴(kuò)大，能夠?qū)崿F(xiàn)低拷貝模板檢測(cè)。

2.3 病原微生物耐藥檢測(cè)

基因芯片技術(shù)能夠檢測(cè)單核苷酸，還能夠檢測(cè)基因的特異性。目前，已經(jīng)各種微生物耐藥檢測(cè)產(chǎn)品面世。比如TMDD變異檢測(cè)基因芯片試劑盒和HBV核酸，能夠在用一時(shí)間內(nèi)，對(duì)HBV多聚酶進(jìn)行分析，在檢測(cè)的2 000多份人類血液樣本中，測(cè)序的檢測(cè)結(jié)果和芯片的檢測(cè)結(jié)果，具有高達(dá)98%的符合率。在臨床實(shí)驗(yàn)上，這樣的高符合率，能夠作為HBV病患抗病毒的給藥依據(jù)[6]。DNA的微陣列芯片法，即結(jié)核分支桿菌耐藥基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)盒，針對(duì)異煙肼的耐藥因素進(jìn)行精確的檢測(cè)，能夠確定臨床試驗(yàn)當(dāng)中，結(jié)核患者在分離的結(jié)核桿菌標(biāo)本當(dāng)中的藥敏現(xiàn)象，能夠針對(duì)結(jié)核患者的早期癥狀進(jìn)行確診，并且能夠盡早介入和治療結(jié)核患者的初期癥狀，對(duì)于結(jié)核病人的預(yù)防和早期控制具有重要的意義和作用。

2.4 生物芯片信號(hào)檢測(cè)技術(shù)

在傳染病的檢測(cè)領(lǐng)域，物芯片信號(hào)檢測(cè)技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用，并且具有光明而廣闊的應(yīng)用發(fā)展。但是，物芯片信號(hào)檢測(cè)技術(shù)的推廣和應(yīng)用具有阻礙，原因在于芯片技術(shù)的欠發(fā)達(dá)導(dǎo)致的靈敏度較低的問(wèn)題，和對(duì)于芯片的使用過(guò)程中，對(duì)于使用設(shè)備的要求較高。在這樣的現(xiàn)實(shí)狀況之下，物芯片信號(hào)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展還是取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步和發(fā)展。對(duì)于普通的檢測(cè)需求，將有機(jī)熒光作為基礎(chǔ)的物芯片信號(hào)檢測(cè)手段非常便捷，方法也愈加成熟。但是熒光芯片還具有諸多問(wèn)題，諸如：熒光芯片的靈敏度較低，熒光容易消失，需要利用特殊的掃描儀器才能實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)等等。

3 核酸擴(kuò)增技術(shù)

3.1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)

20年前，美國(guó)著名的Applied Biosystems公司發(fā)明并公布了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)這一研究成果[7]。隨后，因?yàn)閷?shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)的諸多優(yōu)勢(shì)，在有關(guān)傳染病的微生物實(shí)驗(yàn)室方面，被世界領(lǐng)域一直被認(rèn)為是最有效的方法。因此，獲得產(chǎn)品的批準(zhǔn)較多。近些年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)在急性呼吸方面疾病、甲型H1N1流行性感冒等新型的疾病當(dāng)中，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)能夠針對(duì)病原體進(jìn)行精準(zhǔn)的確認(rèn)、檢測(cè)和治療，因此，其在新型突發(fā)疾病方面具有難以取代的地位。

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)具有3個(gè)基本的化學(xué)原理類型：猝滅染料引物法、探針?lè)ㄒ约癉NA結(jié)合染料法。探針?lè)ㄒ约癉NA結(jié)合染料法能夠檢測(cè)出非特異反應(yīng)產(chǎn)物，比如引物二聚體等，但是DNA結(jié)合染料法在傳染病的臨床試驗(yàn)中的運(yùn)用非常少見(jiàn)，其原因在于特異性較弱。探針?lè)ㄔ谖覈?guó)傳染病的治療中應(yīng)用較為廣泛。在檢測(cè)過(guò)程中，探針?lè)ɡ脽晒夤舱衲芰窟w移來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能和作用，但是探針?lè)ǖ膽?yīng)用范圍僅局限于特異性擴(kuò)增，原因在于特異性較強(qiáng)。

3.2 核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

近些年來(lái)，相關(guān)領(lǐng)域研究出體核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它是外核酸擴(kuò)增技術(shù)，從始至終在同一個(gè)溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，與PCR技術(shù)具有明顯不同之處。核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的試驗(yàn)流程非常簡(jiǎn)單、便捷，也并不需要精確嚴(yán)密的控制溫度的實(shí)驗(yàn)儀器，操作起來(lái)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，比如：靈敏度高、反應(yīng)快等等。在臨床試驗(yàn)和要求速度的診斷行為中，具有廣闊而良好的發(fā)展前景。

4 生物傳感技術(shù)

生物傳感技術(shù)的構(gòu)成是信號(hào)處理和生物感應(yīng)兩種生物元件，它是用于各種生物和化學(xué)的反應(yīng)檢驗(yàn)系統(tǒng)。生物傳感技術(shù)是生物傳感器通過(guò)傳感標(biāo)的物和生物傳感元件二者的互相作用而產(chǎn)生的信號(hào)，利用此信號(hào)對(duì)響應(yīng)進(jìn)行接受、加工，而后進(jìn)行變換，再輸出，利用這樣的過(guò)程來(lái)對(duì)標(biāo)的物實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)和分析。

5 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前，高通量的測(cè)序具有操作繁復(fù)、成本高、分析軟件欠完善等諸多問(wèn)題，為其在病原體檢測(cè)方面的應(yīng)用和發(fā)展帶來(lái)了問(wèn)題。相信在工業(yè)級(jí)軟件和醫(yī)學(xué)軟件的不斷發(fā)展，能夠促進(jìn)高通量測(cè)序逐漸變成病原體檢測(cè)的主流技術(shù)之一。利用生物芯片對(duì)傳染病分子進(jìn)行診斷，此領(lǐng)域急需破解的技術(shù)難題，是生物芯片技術(shù)以及相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)。目前，生物芯片技術(shù)正向著微量、全自動(dòng)、集成等方面發(fā)展。同時(shí)，我國(guó)關(guān)于傳染病分子診斷還具有諸多問(wèn)題：①我國(guó)缺少具有自主創(chuàng)新的分子診斷技術(shù)。②我國(guó)分子診斷產(chǎn)品缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)和保證檢驗(yàn)結(jié)果的精確性。③普遍的分子診斷產(chǎn)品較多，缺少特殊病原體的檢驗(yàn)產(chǎn)品。以上問(wèn)題的解決，將有助于我國(guó)傳染病分子診斷領(lǐng)域的不斷發(fā)展。

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R446

A

1672-5654（2017）03（b）-0046-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.08.046

2016-12-10）

池曉峰（1979-），男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)，免疫學(xué)檢驗(yàn)等方面的工作。