鎂合金內(nèi)皮細(xì)胞相容性研究

鎂合金內(nèi)皮細(xì)胞相容性研究

【作 者】溫賢濤1,2，賀學(xué)英1,2

1 北京市醫(yī)療器械檢測(cè)所， 北京市，101111

2 醫(yī)療器械檢驗(yàn)與安全性評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市，101111

血管再狹窄是血管支架應(yīng)用中存在的主要問(wèn)題之一，而血管支架植入后迅速內(nèi)皮化對(duì)解決血管再狹窄問(wèn)題起著至關(guān)重要的作用。近年鎂合金支架研究是可降解血管支架研究中的熱點(diǎn)之一，材料與內(nèi)皮細(xì)胞相容性是鎂合金材料研究中的關(guān)鍵點(diǎn)之一。該文綜述了近年鎂合金與內(nèi)皮細(xì)胞相容性研究，介紹了主要研究方法、影響內(nèi)皮細(xì)胞相容性的因素、研究存在的不足及以后的研究方向。

鎂合金；內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞相容性

【 Writers 】WEN Xiantao1,2, HE Xueying1,2

1 Beijing Institute of Medical Device Testing, Beijing, 101111

2 Beijing Key Laboratory of Medical Device Testing and Safety Evaluation, Beijing, 101111

【 Abstract 】In-stent restenosis is a main problem in the application of stents. It has been proved that rapid endothelialization of stents after implantation is the key point for solving the problem of restenosis. Recent years researchers focus on developing biodegradable magnesium alloy stents. The cytocompatibility is essential for the design of magnesium alloy stents. In this article, recent research about the endothelial cytocompatibility of magnesium alloy was reviewed, including methods, results, shortcomings and advice.

0 引言

血管支架植入已成為解決血管狹窄性病變的重要手段之一。目前不銹鋼、鎳鈦合金及鈷鉻合金的支架已廣泛應(yīng)用于臨床，但是支架植入后血管再狹窄問(wèn)題卻成為支架臨床使用中亟待解決的問(wèn)題。血管再狹窄的主要原因是不可降解支架作為永久植入物，長(zhǎng)期刺激血管壁，導(dǎo)致血管功能紊亂和血管內(nèi)膜增生，從而導(dǎo)致血管再狹[1]。一般認(rèn)為支架植入后迅速內(nèi)皮化及抑制平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)能降低血管再狹窄率[2]。研究人員在這一方面做了大量的工作，目前已開(kāi)發(fā)出藥物釋放支架，釋放抑制平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物，防止支架植入部位再狹窄，但是再狹窄問(wèn)題仍未得到根本解決?？山到庵Ъ艿母拍畋惶岢鰜?lái)后，研究人員希望這種支架在完成一段時(shí)間的力學(xué)支撐后能逐漸降解消失，解決永久植入支架對(duì)血管造成刺激的問(wèn)題，從而解決血管再狹窄問(wèn)題[3]。目前可降解血管支架研究中鎂合金支架是最有前景的研究方向之一，但仍存在的降解速度過(guò)快及力學(xué)性能較差等問(wèn)題[4]。為了提高抗腐蝕性能及力學(xué)性能，研究人員致力于鎂合金材料的優(yōu)化，包括對(duì)鎂合金成分優(yōu)化和對(duì)鎂合金表面進(jìn)行處理。鎂合金材料在理化性能得到優(yōu)化的同時(shí)，是否能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移也必須考慮，這直接影響到鎂合金支架植入后能否迅速內(nèi)皮化，進(jìn)而防止后期血管再狹窄的發(fā)生。本文綜述了近年鎂合金內(nèi)皮細(xì)胞相容性的相關(guān)研究，總結(jié)主要研究方法、研究結(jié)果、分析影響因素及提出以后的研究方向。

1 主要研究方法

鎂合金內(nèi)皮細(xì)胞相容性研究方法主要是采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，將內(nèi)皮細(xì)胞與鎂合金或鎂合金浸提液進(jìn)行接觸，培養(yǎng)一定時(shí)間后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，如細(xì)胞活性及增殖，細(xì)胞凋亡及壞死，細(xì)胞粘附與遷移以及相關(guān)基因的表達(dá)等。

目前常用于研究的內(nèi)皮細(xì)胞有人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs），人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Coronary Artery Endothelial Cells，HCAECs）及人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Aorta Endothelial Cells，HAECs），也有融合細(xì)胞株如EA.hy926[5]。細(xì)胞種類的選擇應(yīng)該與材料研究的目的相匹配，對(duì)于血管支架內(nèi)皮化的相關(guān)研究，應(yīng)該首選內(nèi)皮細(xì)胞。有些研究者并未使用內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞相容性的研究，而是選用其它細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞等[6]。所得出的結(jié)果最多只能作為初步的細(xì)胞毒性篩選，不能預(yù)示材料是否有良好的內(nèi)皮細(xì)胞相容性。

細(xì)胞活性及增殖主要采用的方法有MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，LDH法檢測(cè)細(xì)胞毒性、BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖等。MTT法中MTT為二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽，能被活細(xì)胞攝取，并在線立體中被脫氫酶還原成甲瓚，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。用二甲亞砜將甲瓚溶解出來(lái)，測(cè)其吸光度，從而推測(cè)細(xì)胞的活性，因此MTT法間接反應(yīng)了活細(xì)胞的數(shù)量。LDH法檢測(cè)細(xì)胞毒性的原理是LDH（乳酸脫氫酶）是穩(wěn)定的胞漿酶，存在所有的細(xì)胞中，當(dāng)胞膜損傷時(shí)快速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的活性，可判斷細(xì)胞受損的程度。LDH法反映材料對(duì)細(xì)胞損傷的情況。BrdU法中BrdU是一種胸腺嘧啶核苷的類似物，能在細(xì)胞合成期摻入到DNA中去，因此通過(guò)一些方法測(cè)得摻入到DNA中的BrdU含量能間接反映細(xì)胞增殖情況。Zhao等[7]認(rèn)為溶液pH值偏堿性或含過(guò)多Ca離子時(shí)，MTT法可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。相比LDH和MTT法，BrdU法更適合鎂基材料細(xì)胞相容性研究，因?yàn)樵谘芯磕承╇x子對(duì)細(xì)胞作用時(shí)BrdU法更敏感。

細(xì)胞凋亡與壞死一般使用專門的檢測(cè)試劑盒，其原理是凋亡的細(xì)胞和壞死的細(xì)胞被不同的染料染色，然后用流式細(xì)胞儀分選或免疫熒光儀進(jìn)行觀察，可以得到細(xì)胞凋亡和壞死的比例數(shù)據(jù)或直觀圖片信息。

細(xì)胞粘附及形貌可采用掃描電鏡（SEM）觀察或免疫熒光方法觀察。SEM觀察需要先對(duì)樣品進(jìn)行固定、脫水及噴金等處理程序后，再進(jìn)行觀察。而免疫熒光觀察方法，則是用染料對(duì)細(xì)胞中相關(guān)蛋白或DNA進(jìn)行染色，在免疫熒光儀下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，能直觀地看到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞遷移可采用刮痕法，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)板中形成單層覆蓋時(shí)，用毛細(xì)玻璃在培養(yǎng)板中劃一條直線，培養(yǎng)板上形成一條無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)的空白帶狀區(qū)域，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞向空白區(qū)域遷移的情況，并根據(jù)帶狀區(qū)域?qū)挾然蛎娣e的變化計(jì)算細(xì)胞的遷移速率[7-8]。相應(yīng)計(jì)算公式為，RR=(initial gap width-current gap width)/(initial gap width) 和 RS=RR/time，其中RR為再覆蓋率，RS為再覆蓋速率。

相關(guān)基因表達(dá)主要采用RT-PCR方法，提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中mRNA作為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。目前鎂合金對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)影響的研究主要涉及血管發(fā)生、細(xì)胞粘附、炎性反應(yīng)、血小板激活等相關(guān)基因[7,9]。

2 主要研究結(jié)果

鎂合金支架材料研究主要集中在鎂合金成分優(yōu)化及鎂合金表面改性，目的在于提高鎂合金力學(xué)性能和抗腐蝕性能力[10]。對(duì)于鎂合金成分的優(yōu)化，除了Al, Zn, Ca, Li, Sr, Mn等元素外，在鎂合金中加入稀土元素是近年的研究熱點(diǎn)。目前大部分的研究表明加入稀土元素后，鎂合金有更好的內(nèi)皮細(xì)胞相容性。Zhao[11]等研究了四種含有不同成分稀土元素(Y, Gd, Dy, Nd)的鎂合金與人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）的相容性，用材料的浸提液與細(xì)胞接觸，結(jié)果顯示四種稀土鎂合金都比純鎂對(duì)照表現(xiàn)出更好的內(nèi)皮化性能，并發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞粘附的早期Dy離子可能對(duì)粘附有抑制作用。Ge[8]對(duì)含有稀土元素的鎂合金（Mg-Y-Nd-Zr）進(jìn)行人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）相容性研究，同樣用鎂合金浸提液與細(xì)胞接觸，進(jìn)行細(xì)胞粘附和細(xì)胞遷移的研究，結(jié)果也顯示含稀土元素的鎂合金比純鎂更利于細(xì)胞的粘附。相比純鎂，鎂合金抗腐蝕性能明顯提高，降解產(chǎn)物的產(chǎn)生速率和pH升高都相對(duì)放緩，更有利于內(nèi)皮細(xì)胞粘附與遷移。Horie M[12]等發(fā)現(xiàn)金屬降解產(chǎn)物可能會(huì)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生。Carins R A[13]等認(rèn)為ROS在低濃度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖，但是高濃度時(shí)會(huì)破壞DNA和其他生物大分子，導(dǎo)致增殖下降甚至細(xì)胞凋亡。Wang等[14]研究認(rèn)為稀土元素能有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成NO，這將有利于支架內(nèi)皮化。

少量的研究者進(jìn)一步研究了鎂合金成分離子對(duì)細(xì)胞的影響。目前研究表明10 mmol/L Mg離子濃度是適合內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移的濃度。Zhao[7]與 Maier JA[15]的研究都發(fā)現(xiàn)10 mmol/L MgCl2能刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Katrin S[9]的研究認(rèn)為10 mmol/L Mg離子時(shí)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)影響最小。Banai[16]的研究認(rèn)為4 mmol/L Mg離子能促進(jìn)細(xì)胞遷移。Zhao還發(fā)現(xiàn)當(dāng)MgCl2高于40 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞活性及遷移受到明顯影響，這結(jié)果與Andreas D[17]的研究結(jié)果相近。Mg離子是人體內(nèi)含量第四的離子，參與人體的生理和代謝過(guò)程，影響細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控信號(hào)傳遞等。離子濃度的改變可能導(dǎo)致信號(hào)通道改變，這些通道可能與細(xì)胞周期、酶活性下降及DNA復(fù)制錯(cuò)誤增加相關(guān)。Zhao研究表明Mg離子能改變30多種與血管再生和細(xì)胞粘附信號(hào)通路相關(guān)的基因表達(dá)。此外，Zhao還研究了其它成分離子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響，如Ca, Zn, Al及稀土元素Y, Dy, Nd, Gd等對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示Zn離子的半數(shù)有效濃度為130 μmol/L 左右，Al離子為2.4 mmol/L 左右，而四種稀土元素半數(shù)有效濃度則在710 μmol/L 到990 μmol/L 。研究還認(rèn)為與平滑肌細(xì)胞和成骨肉瘤細(xì)胞相比，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)稀土成分更敏感。

除了對(duì)鎂合金合金成分種類及含量進(jìn)行不斷優(yōu)化，研究者們還對(duì)鎂合金進(jìn)行表面改性來(lái)提高鎂合金理化性能及生物相容性。表面處理方法主要包括改變表面成分和微結(jié)構(gòu)，如進(jìn)行氟化處理，微弧氧化處理等。或者在合金表面再增加新的覆蓋層CaP沉積層，PEO、PTMC、PCL等有機(jī)膜層。Zhao[18]及Andreas D[17]分別研究了不同鎂合金氟化處理后與內(nèi)皮細(xì)胞的相容性，結(jié)果顯示氟化處理后的鎂合金更利于內(nèi)皮化。一般認(rèn)為氟化處理后，鎂合金降解速度變慢，pH值變化更小，氫氣產(chǎn)生量也更少，因此更利于細(xì)胞的粘附及遷移。Zhang[19]認(rèn)為氟化處理后，鎂合金表面Zeta電位相比未處理前更低，表面親水性能提高，這可能也是細(xì)胞相容性提高的原因之一。除了優(yōu)化鎂合金降解性能，一些研究者還開(kāi)發(fā)出藥物釋放鎂合金支架，裝載抗凝血或抑制平滑肌生長(zhǎng)的藥物[20]。紫杉醇是已被作為抑制平滑肌生長(zhǎng)的藥物用于藥物釋放支架。除了紫杉醇，Zhang[21]對(duì)載有阿魏酸（Ferulic acid，F(xiàn)A）的鎂合金支架進(jìn)行研究，結(jié)果顯示FA能促進(jìn)HUVECs的粘附、遷移及增殖。Zhang認(rèn)為FA能有效地抑制氧化應(yīng)激（Oxidative stress）引起的損傷而導(dǎo)致的NO減少或促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放NO。一般認(rèn)為氧化應(yīng)激會(huì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞，影響細(xì)胞的遷移，從而影響內(nèi)皮化過(guò)程。NO是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要介質(zhì)，被視作內(nèi)皮細(xì)胞的存活因子。NO能及時(shí)地清除過(guò)氧化物和防止由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)NO還能促進(jìn)細(xì)胞遷移和調(diào)節(jié)血管再生。此外，Zhang 認(rèn)為載藥膜的厚度和載藥量對(duì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)也有影響，并指出目前已上市的藥物釋放支架表面的藥物載體膜可能太薄，厚度只有20 μm左右，從中釋放出來(lái)的藥物不能維持長(zhǎng)期促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

3 研究的不足與未來(lái)的方向

細(xì)胞相容性研究為體外實(shí)驗(yàn)，其優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)省時(shí)，是生物材料研究過(guò)程中重要的初篩手段，也是一些機(jī)理研究的必要手段。但體外實(shí)驗(yàn)值得考慮的問(wèn)題是結(jié)果能否真實(shí)地反應(yīng)體內(nèi)的實(shí)際情況。體外實(shí)驗(yàn)通常不可能完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境，導(dǎo)致體外研究結(jié)果與體內(nèi)研究結(jié)果存在差異。例如內(nèi)皮細(xì)胞相容性研究多是在培養(yǎng)板中靜態(tài)進(jìn)行，而鎂合金支架植入到血管后，鎂合金表面處于血流動(dòng)態(tài)環(huán)境中。又如大多數(shù)體外實(shí)驗(yàn)中鎂合金材料制作為片狀，或者使用鎂合金的浸提液，而與實(shí)際應(yīng)用時(shí)性狀相差很大。再如研究鎂合金釋放出的離子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響時(shí)，大多是對(duì)單一離子進(jìn)行研究，而體內(nèi)環(huán)境中各種離子共存，并同時(shí)對(duì)細(xì)胞起作用，較體外復(fù)雜得多。因此我們?cè)谑褂们叭说捏w外研究結(jié)果時(shí)應(yīng)該慎重，盡可能地尋找體內(nèi)的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行支持。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解釋時(shí)，也應(yīng)該充分考慮這種差異。

一般來(lái)說(shuō)材料本體性質(zhì)影響材料的功能和使用期限等，而材料表面性質(zhì)則會(huì)影響到材料與機(jī)體的生物學(xué)效應(yīng)，如表面的化學(xué)成分、表面形貌、表面粗糙度、表面電荷及表面能等。此外，對(duì)于可降解材料還應(yīng)該考慮降解產(chǎn)物的影響。目前關(guān)于鎂合金內(nèi)皮細(xì)胞相容性研究還不多，也不夠深入，還有許多方面需要開(kāi)展深入的研究。例如鎂合金表面形貌，表面粗糙度、表面電荷及表面能等對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)遷移的影響。這些研究結(jié)果能更好的指導(dǎo)鎂合金材料研究者調(diào)整優(yōu)化方向。

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Research on Endothelial Cytocompatibility of Magnesium Alloy

magnesium alloy, endothelial cells, cytocompatibility

R318

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2017.02.012

1671-7104(2017)02-0120-03

2016-08-17

溫賢濤，E-mail: wenxiantao@bimt.org.cn