中藥多糖調(diào)節(jié)腸道菌群研究進展

李蒙子，邱芳馳，陳 倩，劉若彤，于俊妍，孫 嵩，王彥芳

(山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355)

通常，腸道菌群、宿主、外界環(huán)境三者保持著動態(tài)平衡，但因藥物代謝、菌叢變化、腸道動力異常、年齡、飲食習慣與免疫功能失常等原因[1-3]，這種平衡可被打破，使腸道菌群失調(diào)，引起宿主機體的病理改變，如引起炎癥性腸病、腸易激綜合征、肝臟疾病、糖尿病甚至多器官衰竭等[3]。現(xiàn)代醫(yī)學對腸道菌群失調(diào)的治療手段主要有活菌補菌(即益生菌補菌)和自身腸道菌增殖(即益生元補菌)[4]，在治療原發(fā)病基礎(chǔ)上配合使用抗生素及微生態(tài)制劑。

多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、抗病毒、抗炎等多種生物活性、毒副作用小、不易造成殘留等優(yōu)點[5-6]。近年來，中藥多糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用逐漸受到重視。中藥多糖在調(diào)節(jié)腸道菌群方面具有許多優(yōu)越性，其存在廣泛、穩(wěn)定性強、較易保存和價格較低等，且研究發(fā)現(xiàn)天然多糖具有緩控釋作用[7]，具有良好的靶向性。相較于常規(guī)治療方法，中藥多糖毒副作用更小，更安全，適用年齡段也更廣泛?，F(xiàn)將中藥多糖的研究進展綜述如下。

1 中藥多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的研究方法現(xiàn)狀

1.1 體內(nèi)檢測

標本一般取無菌腸道內(nèi)容物或糞便。

1.1.1傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式 吳秀等[8]通過無菌取小鼠盲腸內(nèi)容物依次加入無菌生理鹽水稀釋至10-6后采用涂布法接種的方法培養(yǎng)，根據(jù)各菌落在各自選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征及革蘭染色、芽胞染色進行初步鑒定菌種，來研究大腸桿菌等腸道菌種的變化。觀察菌落形態(tài)并計數(shù)，結(jié)果以菌落形成單位/克(CFU/g)的對數(shù)表示。王廣[9]利用無菌取盲腸內(nèi)容物稀釋后吸取標本接種于各培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)后，根據(jù)稀釋度計算平均菌落數(shù)的方法來檢測黨參多糖對腸道菌群的影響。王庭欣等[10]在研究海帶多糖對腸道菌群的影響時，采用了無菌取糞便，用生理鹽水稀釋成不同稀釋度的菌液，選擇合適的稀釋度，分別接種在各選擇性培養(yǎng)基上，根據(jù)菌落來判斷菌種的方法。張在強等[11]也同樣通過無菌采集小鼠糞便稀釋后利用涂布法涂布于各培養(yǎng)基后根據(jù)培養(yǎng)條件、革蘭染色鏡檢和API生化反應鑒定的方法來檢測夾江石斛對小鼠腸道菌群的影響。

綜合各位學者的實驗，腸道菌群鑒定所需的選擇培養(yǎng)基及初步鑒定條件為：大腸桿菌：在EMB 培養(yǎng)基37℃需氧培養(yǎng)24h，形成具黑色中心帶有金屬光澤或無光澤的菌落，革蘭染色陰性，芽孢染色陰性。脆弱擬桿菌：在 BBE 培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48h，形成圓形，微凸，灰白色，表面光滑，邊緣整齊的菌落，革蘭染色陰性，芽孢染色陰性。雙歧桿菌：在 BS 培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48h，形成菌落光滑、凸圓，白色或乳白色的菌落，革蘭染色陽性，芽孢染色陰性。乳酸桿菌：在乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48h，形成白色，近圓形，邊緣整齊的小菌落，革蘭染色陽性，芽孢染色陰性[8-9]。乳桿菌：在LBS 培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48h，形成乳白色，透明狀菌落。腸球菌：在疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂37℃需氧培養(yǎng)48h，形成有明顯褐色圈的菌落[10-11]。

1.1.216S rDNA檢測 16S rDNA技術(shù)是目前常用于細菌鑒定的一項技術(shù)，主要用于常規(guī)工作表型難于鑒定的細菌。通常利用300～900bp的靶序列即可進行多數(shù)廣譜PCR診斷,檢測過程主要包括提取目的基因模板、PCR擴增目的基因模板、確定目的基因條帶、尋找并排除16SrDNA污染、分析16SrDNA序列、選擇數(shù)據(jù)庫及解釋序列[12]。擴增目的基因序列一般選擇細菌通用引物63F和1387R 完成對細菌 16S rDNA全基因擴增[13]。擴增時一般選用25μL或50μL體系，擴增條件為95℃加熱10min之后，進行30個循環(huán)，95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 45s。擴增完成后，篩選陽性條帶并盡量避免陰性對照產(chǎn)生的陽性條帶。分析 16S rDNA序列時主要依靠序列相似百分率。一般先確定序列變化較大的屬然后再種間比較，99%～99.5%等同率常常被接受。種水平比較必要時應采用生化實驗輔助最后的解釋[12]。

路上云等[13]采用環(huán)磷酰胺化療模型，無菌收集小鼠糞便并提取細菌基因組DNA，構(gòu)建各組小鼠腸道細菌的16S rDNA 克隆文庫，單酶切分型來檢測魷魚墨多糖對小鼠腸道菌群多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)魷魚墨多糖對化療模型小鼠腸道菌群種類有一定調(diào)節(jié)作用。何旭云等[14]對高脂飲食誘導的肥胖小鼠給予黃芪多糖，無菌收集小鼠糞便并利用基于細菌16S rDNA測序的元基因組學方法發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可恢復高脂喂養(yǎng)小鼠的腸道紊亂現(xiàn)象。

常規(guī)培養(yǎng)方法主要是根據(jù)細菌分解葡萄糖、乳酸和尿素是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣等使培養(yǎng)基產(chǎn)生可見變化來鑒別[15]，具有一定局限性。對于對培養(yǎng)條件要求苛刻、對環(huán)境敏感不易成活、種屬間形態(tài)染色等特征差異較小的菌種來說，常規(guī)培養(yǎng)鑒別難度系數(shù)較高，16S rDNA檢測技術(shù)較好地補充了這一缺點，其檢測結(jié)果更準確也更精確，對于種屬的鑒別結(jié)果相對培養(yǎng)法也更直觀，菌種對環(huán)境的依賴性也不易對檢測產(chǎn)生影響，較少的樣本即可檢測。目前，16S rDNA技術(shù)越來越快捷，檢測成本也越來越低，大大節(jié)約了研究人員的時間。通過Ion Torrent PGM系統(tǒng)上機測序、FASTX Toolkit 0.0.13軟件對測序的結(jié)果進行過濾的方法[14]，一般在1.5個工作日內(nèi)即可完成。不過，該技術(shù)大多依靠16S rDNA序列等同率一個指標鑒定細菌，故而具有一定局限性。對于種屬十分接近的菌種，基因序列的選擇和篩選的不同，或許也會導致實驗結(jié)果出現(xiàn)誤差；技術(shù)操作過程中，為避免陰性對照出現(xiàn)陽性條帶，對操作環(huán)境和操作技術(shù)的要求也更高。

1.2 體外檢測

曾艷華等[16]體外研究大蒜多糖對健康成人新鮮糞便中擬桿菌的影響，將健康成人新鮮糞便懸浮于PBS緩沖液(pH 7.3)中制成糞懸液，接種到以 1%的大蒜多糖各樣本以及菊糖(果糖含量為 93.2%)和葡萄糖作為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以PBS緩沖液(pH 7.3)梯度稀釋發(fā)酵液，并將不同梯度發(fā)酵液涂布到擬桿菌選擇性培養(yǎng)基中，計算單菌數(shù)目，再用羊血平板對單菌落多次劃線分離純化，經(jīng)革蘭氏染色鑒定為純菌，該實驗證明大蒜多糖對擬桿菌具有益生作用。王廣[9]體外研究黨參多糖對雙歧桿菌和大腸桿菌的影響，將雙歧桿菌和大腸桿菌分別接種于雙歧桿菌培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48～72h后，分組，并將菌液分別接種于10mL PYG 培養(yǎng)基中，用藥組和對照組分別給予動物實驗組最佳黨參多糖用量及等量無菌生理鹽水干預，37℃厭氧培養(yǎng)48h，稀釋雙歧桿菌及大腸桿菌，并將雙歧桿菌接種于BL培養(yǎng)基、大腸桿菌接種于EMB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選適宜菌落計算平均菌落數(shù)，來檢測用藥后活菌數(shù)目的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黨參多糖體外對大腸桿菌生長不存在抑制或促進作用，但可促進雙歧桿菌生長。

體外檢測使多糖直接作用于細菌，避免了動物體內(nèi)未知因素的干擾，更加直觀。但是，由于缺少動物體內(nèi)環(huán)境的動態(tài)變化，實驗結(jié)果并不能完全等同于中藥多糖對動物體內(nèi)菌群的影響。

2 中藥多糖調(diào)節(jié)腸道菌群研究現(xiàn)狀

2.1 補益藥

補益藥主要涉及黨參、黃芪、山藥等。王廣等[9]通過0.3g/mL鹽酸林可霉素灌胃使小鼠腸道菌群失調(diào)，并通過不同濃度的黨參多糖對腸道菌群失調(diào)模型小鼠進行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黨參多糖可以通過促進雙歧桿菌的生長，提高乙酸的代謝、抑制外籍菌及腸道潛在致病菌過度生長繁殖，發(fā)揮調(diào)整微生態(tài)失調(diào)的作用。梁金花等[17]采用TNBS/乙醇液法建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，用黃芪多糖對該模型進行調(diào)整性治療，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖使大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌含量明顯上升，腸球菌、腸桿菌含量下降，大鼠腸道菌群比例恢復正常，大鼠結(jié)腸內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸的含量升高，肝臟細菌易位得到有效地控制，黃芪多糖具有調(diào)整腸道微生態(tài)失調(diào)的作用，且其作用優(yōu)于麗珠腸樂。程翔[18]利用鹽酸林可霉素灌胃致腸道菌群失調(diào)的模型小鼠給予枸杞多糖后發(fā)現(xiàn)模型小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌上升，與自然恢復組相比，差異非常有顯著性，且在多樣分析中枸杞多糖對腸道菌群作用優(yōu)于麗珠腸樂，是理想的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑。中藥多糖除了針對腸道菌群失調(diào)具有調(diào)節(jié)作用，對其他疾病所致腸道菌群失調(diào)也具有一定改善作用。高辛等[19]通過對急性肝衰竭模型大鼠給予納米山藥多糖治療發(fā)現(xiàn)，模型小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量增加，腸球菌、腸桿菌、類桿菌數(shù)量明顯下降并出現(xiàn)菌群易位改善。

2.2 清熱藥

清熱藥主要涉及蒲公英、桑葉、錦燈籠、黃芩等。石丹等[20]通過用林可霉素灌胃制備腸道菌群失調(diào)小鼠模型，觀察蒲公英多糖對小鼠影響，發(fā)現(xiàn)小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量增加，腸桿菌和腸球菌數(shù)量減少，蒲公英多糖能顯著改善林可霉素致腸道菌群失調(diào)小鼠的癥狀。陳漣昊等[21]通過利用鹽酸林可霉素誘導小鼠腸道菌群失調(diào)，給予桑葉多糖發(fā)現(xiàn)小鼠腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象得到了顯著改善。楊光[22]也通過實驗發(fā)現(xiàn)錦燈籠中所提取的酸漿多糖對抗生素所致腸道菌群的失調(diào)小鼠具有刺激雙歧桿菌等益生菌生長、抑制體外病原菌的作用。

2.3 解表藥及瀉下藥

解表藥主要涉及牛蒡子等，瀉下藥主要是大黃。徐永杰等[23]通過對正常小鼠給予牛蒡多糖發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道內(nèi)乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)目均顯著增加，牛蒡多糖能顯著調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群。郭振軍等[24]通過對TNBS誘導的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠給予大黃多糖治療發(fā)現(xiàn)其具有逆轉(zhuǎn)腸道菌群失調(diào)、促進乳酸桿菌和雙歧桿菌增殖、抑制脆弱擬桿菌及腸球菌增殖的作用，但含有蒽醌的大黃多糖效果更優(yōu)，對脆弱擬桿菌及腸球菌抑制作用優(yōu)于不含蒽醌的大黃多糖 。

2.4 其他

在多糖對腸道菌群失衡的調(diào)節(jié)作用的研究中，一些臨床較少見的藥物及復方的多糖成分也是研究的熱點之一。王庭欣等[10]通過利用海帶多糖對小鼠灌胃發(fā)現(xiàn)海帶多糖能夠促進小鼠腸黏膜對SIgA的分泌量并且能夠增加腸道中乳桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量，但腸桿菌的量沒有影響，可見海帶多糖對腸道菌群具有一定調(diào)節(jié)作用。王雪等[25]通過給予鹽酸林可霉素灌胃建立腸道微生態(tài)失調(diào)模型小鼠長根菇多糖發(fā)現(xiàn)其具有促進小鼠乳酸桿菌、雙歧桿菌恢復，抑制大腸桿菌、腸球菌增殖的作用，調(diào)整和改善腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象?？娫虑锏萚26]通過對腸道菌群的體外培養(yǎng)并給予葫蘆巴多糖經(jīng)酸解和酶解所形成的不同分子量的產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物均可促進雙歧桿菌、乳酸桿菌生長，并抑制大腸桿菌生長。唐華羽等[27]通過脾虛造模，給予四君子湯總多糖發(fā)現(xiàn)造模對照組雙歧桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、脆弱擬桿菌水平均高于正常對照組，四君子湯多糖能糾正腸道菌群失調(diào)，同時可恢復脾虛小鼠的免疫功能，且具有劑量依賴性。廖呂燕等[28]通過給予環(huán)磷酰胺免疫損傷小鼠“芪苓”制劑多糖并檢測其腸道內(nèi)容物發(fā)現(xiàn)，“芪苓”制劑多糖組小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸菌數(shù)量均顯著上升，大腸桿菌、腸球菌均顯著下降，“芪苓”制劑多糖對環(huán)磷酰胺免疫損傷小鼠腸道菌群的紊亂具有拮抗作用。胡新俊等[29]霉素灌胃建立腸道微生態(tài)失調(diào)模型小鼠給予馬齒莧多糖，發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖可使小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量明顯上升，扶正菌群失調(diào)。

綜上所述，馬齒莧多糖、黨參多糖、黃芪多糖、枸杞多糖、山藥多糖、蒲公英多糖、酸漿多糖、牛蒡多糖、大黃多糖、海帶多糖、長根菇多糖、葫蘆巴多糖、“芪苓”制劑多糖均可使雙歧桿菌數(shù)目增加，其中，黃芪多糖、山藥多糖、蒲公英多糖、牛蒡多糖、大黃多糖、海帶多糖、葫蘆巴多糖、“芪苓”制劑多糖又可使乳桿菌數(shù)目增加；黃芪多糖、山藥多糖、蒲公英多糖可使腸桿菌、腸球菌數(shù)目下降，“芪苓”制劑多糖、長根菇多糖、葫蘆巴多糖也可抑制大腸桿菌生長；海帶多糖對腸桿菌無影響。不同的中藥多糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用具有一定選擇性，大都可促進腸道有益菌群的生長，并抑制外籍菌及腸道潛在致病菌過度生長繁殖，達到調(diào)節(jié)腸道菌群的目的，對腸道菌群失調(diào)具有較好的恢復作用。

3 結(jié)論與展望

中藥多糖對失調(diào)腸道菌群所具有的調(diào)節(jié)作用，可促進有益菌生長，部分亦可抑制致病菌生長。無論單味中藥多糖還是中藥復方多糖，對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用都是較為顯著的。目前，部分中藥多糖在臨床應用已證明對中樞神經(jīng)系統(tǒng) 、肝臟、腎臟 、胃腸道病變、燙傷、病毒、細菌感染有顯著療效，對內(nèi)分泌性疾病也具有較好效果[30-31]。隨著中藥多糖對腸道菌群調(diào)節(jié)作用研究的逐漸深入，中藥多糖將在調(diào)節(jié)腸道菌群方面發(fā)揮更重要的作用，臨床上利用不同中藥多糖對菌種的選擇作用或可用于對腸道菌群的靶向性調(diào)節(jié)，中藥多糖調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)具有廣闊的前景，但其臨床效果仍有待考證，最佳給藥方式及最佳給藥量仍有待進一步研究?！?/p>

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