“土貢松”母樹林種子品質(zhì)與遺傳多樣性初步分析

聶永雄，韋 勛，張 榮，張海東，周梓富，白天道*

(1.國營蒼梧縣天洪嶺林場，廣西 蒼梧 534100；2.廣西大學(xué)林學(xué)院，南寧 530004)

“土貢松”母樹林種子品質(zhì)與遺傳多樣性初步分析

聶永雄1，韋 勛2，張 榮1，張海東2，周梓富1，白天道2*

(1.國營蒼梧縣天洪嶺林場，廣西 蒼梧 534100；2.廣西大學(xué)林學(xué)院，南寧 530004)

種子品質(zhì)及遺傳多樣性是評價良種生產(chǎn)群體優(yōu)劣的重要指標(biāo)。本研究對廣西55a生“土貢松”母樹林種子表型及生活力、性狀間相關(guān)性、子代遺傳多樣性等進(jìn)行了分析研究，表明：不同采種母樹在種子表型性狀(種子長、種子寬、種翅長、種翅寬、種子長寬比、種翅長寬比、千粒重)及種子生活力(萌發(fā)率、胚根長度)上均存在極顯著差異(P\%<0.0001);不同母樹種子的萌發(fā)率在47%～95%之間;種子表型性狀與種子生活力性狀無顯著相關(guān)性;母樹林具有較廣泛的遺傳基礎(chǔ)，基因期望雜合度、Nei期望雜合度分別為0.602、0.588;林內(nèi)個體間存在明顯的授粉不隨機(jī)現(xiàn)象(觀察雜合度0.381<期望雜合度0.602)，可能存在一定程度近交或自交。

“土貢松”；母樹林；種子品質(zhì)；遺傳多樣性

馬尾松(Pinusmassoniana)是中國主要用材樹種之一，廣泛分布于中國南方十多個省市。廣西是馬尾松優(yōu)良種源區(qū)，其馬尾松主要分布于廣西東部和南部地區(qū)。馬尾松土貢種源位于廣西東部梧州市蒼梧縣，其生長表現(xiàn)優(yōu)良，其生長量均高于相應(yīng)立地國家馬尾松速生標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)?shù)厝罕姺Q為“土貢松”[1]。2013年“土貢松”被列為廣西馬尾松良種[2]。

林木種子品質(zhì)的好壞，直接關(guān)系到育苗和造林的成敗，種子品質(zhì)評價對良種生產(chǎn)及人工造林具有重要指導(dǎo)作用[3]?！巴霖曀伞弊鳛閺V西馬尾松優(yōu)良種源，一些文獻(xiàn)在其人工林生長[1]、生物量[4]、產(chǎn)脂力[5]、營養(yǎng)元素分配[6]及木材特性[7]等方面進(jìn)行了報道，但在良種生產(chǎn)群體的遺傳基礎(chǔ)(遺傳多樣性)及種子品質(zhì)方面的研究還極為欠缺。本研究利用位于廣西東南部的一片55a生“土貢松”母樹林作為研究材料，初步分析該林分作為良種生產(chǎn)群體所獲得的種子的生活力及遺傳多樣性水平，以為該母樹林的進(jìn)一步選擇及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于廣西蒼梧縣北部天洪嶺林場土貢分場，地理坐標(biāo)為東經(jīng)111°15′，北緯23°41′ 。屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，光照充足，雨量充沛，年平均氣溫約21 ℃，極端最高溫、最低溫分別為39℃、3℃，年均降水量1503.6mm，年均相對濕度為78%。土壤類型為地帶性紅壤，土壤肥力中等。平均海拔約350m，坡度在11～38°之間。

1.2 試驗材料

試驗材料為天洪林場55a生“土貢松”采種母樹林，造林時間為1959年，種子來源為“土貢松”天然林分混合種，采用裸根苗造林，初始株行距1.7m×1.7m，林分面積2hm2。先后進(jìn)行了多次去劣疏伐，目前保留密度400～450株·hm-2，林分平均胸徑45.31cm，平均樹高為30.06m。

1.3 研究方法

1.3.1 母樹林種子品質(zhì)測定 ①球果采集與脫粒：于2014年10月在母樹林中分別隨機(jī)采集6株采種母樹的球果，每株母樹隨機(jī)采集20個球果，球果脫粒采用削鱗去脂→曝曬脫?！^篩凈種的方法。②種子表型性狀測定：利用電子游標(biāo)卡尺分別測定種子長、種子寬、種翅長、種翅寬進(jìn)行測定，每株母樹隨機(jī)測定100粒種子。③種子千粒重測定：將種子去除種翅，采用四分法抽取測定樣品，重復(fù)4次，每次從樣品中取200粒于電子天平上稱重，換算為千粒重。④種子萌發(fā)率測定：將種子用蒸餾水浸泡12h后置于發(fā)芽盒內(nèi)的濕潤濾紙上，放入恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每株母樹4次重復(fù)，每重復(fù)100粒，定期觀察種子發(fā)芽情況并記錄。待發(fā)芽試驗結(jié)束，測量胚根萌發(fā)長度，并計算萌發(fā)率，萌發(fā)率計算參見GB2772-1999。

1.3.2 遺傳多樣性評價 利用改良CTAB法[8]提取“土貢松”2a生苗木(從母樹林采集的混合種子育苗)針葉DNA(24株)，采用7個SSR分子標(biāo)記(表1)分別對每個植株進(jìn)行基因分型。DNA提取及基因分型方法參見倪州獻(xiàn)等[9]的文獻(xiàn)。

表1 參試的7個SSR標(biāo)記引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析方法

采用Excel2013錄入種子表型及生活力測定數(shù)據(jù)，運用SAS9.3進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析及相關(guān)分析。等位基因數(shù)目(Na)、有效等位基因數(shù)目(Ne)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、多位點觀察雜合度(Ho)及期望雜合度(He)、Nei’s基因多樣度(Nei)等遺傳多樣性評價指標(biāo)利用Popgene(v1.32)軟件計。

2 結(jié)果與分析

2.1 采種母樹種子性狀變異分析

對母樹林種子性狀進(jìn)行測定(表2)，發(fā)現(xiàn)不同母樹間在種子表型性狀及生活力上均存在一定的變異，參試性狀的變異系數(shù)在4.89%(種子長寬比)～47.41%(胚根長度)之間。母樹間在種子長(LS)、種子寬(WS)、種翅長(LW)、種翅寬(WW)、種子長寬比(RLS-WS)、種翅長寬比(RLW-WW)、千粒重(WTS)、萌發(fā)率(GR)及胚根長度(LR)上，最大值分別是最小值的1.16、1.13、1.24、1.19、1.23、1.14、1.84、2.01及3.81倍。

表2 “土貢松”采種母樹種子各參試性狀變異

方差分析表明(圖1)，不同母樹間在種子長(F=57.37, P<0.0001)、種子寬(F=40.17, P<0.0001)、種子長寬比(F=26.14, P<0.0001)及千粒重(F=439.00, P<0.0001)上均存在極顯著差異。同時，母樹間在種翅長(F=31.79, P<0.0001)、種翅寬(F=42.51, P<0.0001)、種翅長寬比(F=38.99, P<0.0001)上也差異極顯著(圖片未列出)。在種子生活力上，“土貢松”不同母樹在種子萌發(fā)率(F=8.66, P<0.0011)及胚根長度(F=196.95, P<0.0001)上同樣存在極顯著差異(圖2)。表明該母樹林內(nèi)不同母樹生產(chǎn)的種子在表型性狀及生活力上均存在明顯差別。比如在種子萌發(fā)率上，1號母樹為95%，而3號母樹僅為47%。據(jù)此可初步推測，當(dāng)前該母樹林生產(chǎn)的種子的品質(zhì)并不一致，存在優(yōu)劣混雜的現(xiàn)象。就參試母樹來看，1號母樹在各個測定性狀上表現(xiàn)相對較優(yōu)，尤其是在種子長度、種子寬度、千粒重、萌發(fā)率及培根長度幾個重要性狀上均優(yōu)于其他母樹的種子。

圖1 “土貢松”不同母樹種子長(LS)、種子寬(WS)、種子長寬比(RLS-WS)及千粒重(WTS)性狀差異

圖2 “土貢松”不同母樹種子萌發(fā)率(GR)及胚根長度(LR)差異

2.2 種子性狀間的相關(guān)性分析

參試性狀相關(guān)性分析結(jié)果顯示(表3)，絕大多數(shù)性狀間不存顯著的相關(guān)性，尤其值得注意的是，萌發(fā)率與種子大小(LS、LW)、重量(WTS)并無顯著的相關(guān)性。僅種子長度(LS)與千粒重(WTS)存在極顯著正相關(guān)，萌發(fā)率(GR)與胚根長度(LR)存在極顯著正相關(guān)，萌發(fā)率(GR)與種翅寬(WW)顯著相關(guān)，種子寬(WS)與種翅長寬比(RLW-WW)存在顯著負(fù)相關(guān)。

表3 “土貢松”種子性狀間的相關(guān)性

2.3 母樹林子代遺傳多樣性

對母樹林子代進(jìn)行遺傳多樣性分析，7個SSR位點均擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定的條帶(圖3)，多態(tài)位點百分率達(dá)100%，檢測到子代群體平均觀察等位基因數(shù)(Na)為2.857，有效等位基因數(shù)(Ne)為2.594，觀察雜合度(Ho)為0.381，期望雜合度(He)為0.602，Nei\%期望雜合度為0.5881(表4)。

7個SSR位點中有6個位點固定指數(shù)均大于零(表5)，表明群體在多個位點存在雜合子不足，推測該林分存在自交或近交現(xiàn)象。

圖3 標(biāo)記Pma.43在24個“土貢松”子代中的擴(kuò)增結(jié)果

位點NaNeIHoHeNeiPma.4332.84441.070.50.66220.6484Pma.4521.81610.64160.50.45980.4494Pma.2232.17870.89490.250.55850.541Pma.2543.95881.38120.58330.76330.7474Pma.6632.90911.08220.41670.67020.6562Pma.7232.61221.02390.41670.63030.6172Pma.1921.84080.649200.47060.4567平均2.85712.59430.96330.3810.60210.5881標(biāo)準(zhǔn)差0.69010.74940.26160.19750.11140.1105

注：Na-觀察等位基因數(shù)，Ne-有效等位基因數(shù)，I-香農(nóng)多樣性指數(shù)，Ho-觀察雜合度，He-期望雜合度，Nei-Nei’s期望雜合度。

表5 參試位點固定指數(shù)

3 結(jié)論與討論

作為良種生產(chǎn)群體，其種子品質(zhì)好壞直接關(guān)系到育苗造林的質(zhì)量。母樹林作為良種生產(chǎn)林分，具有投產(chǎn)快，成本低等優(yōu)點，但是母樹林去劣疏伐僅通過母樹表型，并未經(jīng)過遺傳測定，母樹間在遺傳品質(zhì)上難免出現(xiàn)優(yōu)劣混雜[10]?！巴霖曀伞辈煞N母樹林種子性狀及生活力研究結(jié)果為，不同采種母樹間在種子表型性狀(種子大小、千粒重)上存在顯著的差別，同時不同母樹間的種子生活力(萌發(fā)率)也有很大差異；種子大小、千粒重與種子萌發(fā)率、胚根長度無顯著的相關(guān)性，這與杉木[11]的研究結(jié)論類似?？紤]到參試母樹間的距離相對較近，立地條件較一致，立地環(huán)境對不同母樹間種子生產(chǎn)造成的影響相對較小，加之母樹間的樹齡也相同，因此，不同母樹間在種子性狀及生活力上產(chǎn)生顯著差異應(yīng)主要源于不同母樹間的遺傳差異；僅根據(jù)種子大小、千粒重不足以判斷“土貢松”種子的優(yōu)劣。種子生活力應(yīng)是一個重要的評價指標(biāo)。

林木群體的遺傳多樣性與其遺傳基礎(chǔ)和異交水平有關(guān)，較低的遺傳多樣性或非隨機(jī)交配會增加群體近(自)交的概率，引起近(自)交衰退，本研究利用SSR標(biāo)記分析顯示該母樹林子代的平均期望雜合度(He及Nei)與大多數(shù)種子園及天群體的水平相當(dāng)[12-14]。說明該母樹林遺傳基礎(chǔ)較寬，滿足良種生產(chǎn)群體的基本要求。但需要指出的是，該群體觀察雜合度(Ho)顯著低于期望雜合度(He)，意味著群體交配不隨機(jī)，可能存在部分個體近交或自交的情況。同時7個SSR位點中有6個位點固定指數(shù)大于零，也證實了群體雜合子不足，存在近交或自交的問題。這也可能是導(dǎo)致該林分部分母樹種子萌發(fā)率較低的原因之一(參試母樹種子萌發(fā)率最低僅47%)。

考慮到該母樹林樹齡已達(dá)55a生，母樹樹體通直高大，枝下高極高，人工輔助授粉極為困難，同時采種成本也極高。建議從該林分乃至整個“土貢松”分布區(qū)域內(nèi)的天然或人工林中挑選遺傳品質(zhì)優(yōu)良、結(jié)實量高的基因型材料，營建“土貢松”優(yōu)良無性系種子園，實現(xiàn)“土貢松”良種生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

[1] 葉錦培,舒文波,嚴(yán)壯洧,等.桂東地區(qū)不同年齡馬尾松土貢種源人工林生長量的比較 [J].廣西林業(yè)科學(xué),2012,41 (1):44-47.

[2] 葉錦培,舒文波,邵錦賢,等.梧州市速生、高抗、高脂 “土貢松”選育及應(yīng)用[M].廣西梧州，2012.

[3] 洑香香,喻方圓,鄭欣民.林木種子采集、加工和貯藏技術(shù)[M].北京:中國林業(yè)出版社,2008.

[4] 劉延男,聶永雄,周梓富,等.土貢優(yōu)良種源馬尾松生物量及生產(chǎn)力研究[J].山西農(nóng)林科學(xué),2015,43 (10):1247-1251.

[5] 羅煉平,舒文波,聶海泉,等.馬尾松土貢種源純林與混交林生長量和產(chǎn)脂力比較[J].廣西林業(yè)科學(xué),2013,42 (1):66-70,90.

[6] 葉錦培,嚴(yán)理,陳梅,等.桂東南地區(qū)速生、高抗、高脂土貢松營養(yǎng)元素分配規(guī)律研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44 (3):364-368.

[7] 嚴(yán)壯洧,陳柏旭,李炎,等.土貢松木材干燥特性研究[J].陜西林業(yè)科技,2015,(3):4-7.

[8] 白天道.利用馬尾松種子園自由授粉子代組建二代育種群體的研究[D].南京; 南京林業(yè)大學(xué),2013.

[9] 倪州獻(xiàn),白天道,蔡恒,等.馬尾松基因組SSR標(biāo)記在松屬其他樹種中的通用性分析 [J].分子植物育種,2015,13 (12):2811-2817.

[10]ZOBELB,TALBERTJ.Appliedforesttreeimprovement[M].JohnWiley&Sons,1984.

[11] 孫鴻有,鄭勇平,翁春媚,等.杉木種子園種子品質(zhì)性狀變異及遺傳參數(shù)[J].浙江林學(xué)院學(xué)報,2005,22 (1):61-65.

[12] 艾暢.馬尾松無性系種子園遺傳多樣性及其自由授粉子代父本組成研究[D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2004.

[13] 趙阿風(fēng).馬尾松無性系指紋圖譜構(gòu)建 [D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2005.

[14]BAIT-D,XUL-A,XUM,etal.Characterizationofmassonpine(PinusmassonianaLamb.)microsatelliteDNAby454genomeshotgunsequencing[J].Treegenetics&genomes,2014,10 (2):429-437.

Seed Quality and Genetic Diversity of Pinus massoniana Seed Production Stand in Guangxi

NIEYong-xiong1,WEIXun2,ZHANGRong1,ZHANGHai-dong2,ZHOUZi-fu1,BAITian-dao2*

(1.Tianhongling State-owned Forest Farm, Cangwu county, Guangxi543100;2.College of Forestry, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004)

Seedqualityandgeneticdiversityareimportantfactorsforevaluatingseedproductionpopulation.Inthisstudy,seedphenotypeandviabilityof55aMassonPineseedstandinGuangxiprovincewereinvestigated.Theresultsshowedthatmothertreesforseedcollectionwerehighlysignificantlydifferentbothinseedphenotypictraitsandseedviability(P\%<0.0001).Theformerincludestheseedlength,seedwidth,seedwinglength,seedwingwidth,aspectratioofseeds,aspectratioofseedwingsandgrainweight,andthelatterconsistsofgerminationrateandradicallength.TheseedgerminationratefromdifferentMassonPinemothertreesrangedfrom47%to95%.Theseedphenotypiccharacterspresentednoobviouscorrelationwiththeseedviabilitytraits.ThegeneticdiversityanalysisforMassonPineoffspringtreeswasconductedintheexperiment,andgeneticexpectedheterozygosity(He),andNei’sexpectedheterozygosity(Nei’)were0.602and0.588,respectively,whichindicatedthattheparentstandpossessedawidergeneticbasis.Inaddition,theobservedheterozygosityat0.381andtheexpectedheterozygosityat0.602meansthatnon-randommatingobviouslyoccurredamongindividuals,whichimpliedinbreedingorselfingcouldexisttosomedegree.

MassonPine;seedproductionstand;seedquality;geneticdiversity

2016-08-14 基金項目：廣西梧州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(201501020)；廣西大學(xué)青年博士科研啟動基金項目(XBZ160142)。

聶永雄(1978-)，男，廣西蒼梧人，工程師，從事林木良種生產(chǎn)與栽培工作。

S791.248;Q

A

*通訊作者