不同宮頸病變組織中人乳頭瘤病毒16型E5基因的研究*

楊嘉潔 曹子洵 梁開(kāi)如 左酌馳 左鳳瓊

(1.成都樹(shù)德中學(xué)，四川 成都 610031；2.四川省婦幼保健院，四川 成都 610031；3.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

不同宮頸病變組織中人乳頭瘤病毒16型E5基因的研究*

楊嘉潔1曹子洵1梁開(kāi)如2左酌馳1左鳳瓊3△

(1.成都樹(shù)德中學(xué)，四川 成都 610031；2.四川省婦幼保健院，四川 成都 610031；3.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

目的：探討人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus type，HPV)16型E5早期基因在臨床宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及宮頸癌患者中的存在情況，判斷HPV16 E5是否能作為臨床宮頸癌的早期診斷治療靶點(diǎn)，以利進(jìn)一步研究HPV16的致癌機(jī)制。方法：從臨床標(biāo)本中篩選出HPV16陽(yáng)性標(biāo)本61例，根據(jù)病理診斷分為5組(宮頸炎組、CINⅠ級(jí)、CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)及宮頸癌組)，再應(yīng)用PCR的方法分別測(cè)定各組組織中HPV16 E5 DNA的表達(dá)情況。結(jié)果：宮頸炎組E5 DNA陽(yáng)性率為58.33%，CINⅠ級(jí)為63.64%，CINⅡ級(jí)為70.00%，CINⅢ級(jí)為44.44%，宮頸癌為77.78%，各組間陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：E5 DNA不僅僅在宮頸癌早期存在，因而E5不能作為臨床宮頸癌的早期診斷靶點(diǎn)，但可作為宮頸癌疫苗研究的靶點(diǎn)。

宮頸癌；人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus type，HPV)16；E5基因

宮頸癌是婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全球婦女惡性腫瘤中，其發(fā)病率僅次于乳腺癌居第二位[1]。世界范圍內(nèi)，每年新發(fā)宮頸癌病例約50萬(wàn)，我國(guó)每年新發(fā)宮頸癌的病例約7.5萬(wàn)[2]，且發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[3]。流行病學(xué)及分子生物學(xué)資料證實(shí)，人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus type，HPV)感染為宮頸癌發(fā)生的必要條件[4-6]，特別是高危型HPV，是宮頸癌重要的致病因子[7]。有資料顯示，宮頸癌病人HPV的陽(yáng)性率為99.7%，其中約有一半的感染亞型為HPV16型[8]。在正常子宮頸由輕(CINⅠ)、中(CINⅡ)、重型(CINⅢ)子宮頸不典型增生到宮頸癌的進(jìn)程中，HPV的感染促進(jìn)了這個(gè)過(guò)程。HPV16刺激宮頸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腫瘤細(xì)胞與其3種早期癌蛋白E5、E6、E7的表達(dá)密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于HPV16 E6、E7的研究較多，而E5的研究資料一直較少。以往的研究認(rèn)為，腫瘤形成早期的階段，E5的轉(zhuǎn)錄體及蛋白非常豐富，晚期腫瘤中的E5常因HPV16病毒整合至宿主細(xì)胞而缺失，但近年有研究認(rèn)為并非所有晚期腫瘤病例均呈現(xiàn)HPV16單純整合，還包括游離型與混合型[5,6]，因此E5在晚期腫瘤細(xì)胞中可能同樣表達(dá)。

本研究通過(guò)收集不同病變程度臨床標(biāo)本，系統(tǒng)研究在宮頸炎癥、典型性增生(Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí))以及宮頸癌患者宮頸組織中HPV16 E5基因情況。通過(guò)分析，我們可獲知臨床HPV16感染宮頸病變中E5DNA的第一手資料，從而獲知HPVE5是否可作為臨床宮頸癌早期診斷的靶點(diǎn)，為臨床宮頸癌的早期診斷和進(jìn)一步研究其致癌機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

所有標(biāo)本均采自于四川省婦幼保健院宮頸門診。選取HPV16陽(yáng)性的相應(yīng)組織樣本61份進(jìn)一步進(jìn)行E5基因的研究。根據(jù)臨床病理診斷分別分為：宮頸炎組、CINⅠ級(jí)、CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)與宮頸癌組。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購(gòu)自潮州凱普生物化學(xué)有限公司；Premix-Tag購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物DL2000購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司。其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 組織標(biāo)本中DNA的提取

采用凱普公司DNA提取試劑盒提取組織中病毒基因組DNA，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 HPV16 E5 DNA的測(cè)定

1.3.2.1 HPV16E5引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中查得的東亞型HPV16全基因序列(基因登陸號(hào)：AF534061)設(shè)計(jì)擴(kuò)增HPV16E5基因的上下游引物。上游引物：5′-GACAAATCTTGATACTGCATCCACA-3′，下游引物：5′-GACACAGACAAAAGCAGCGGAC-3′。擴(kuò)增的片段大小為108 bp，為E5部分基因。內(nèi)參為β-actin，上游引物：5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′，片段大小為132 bp。

1.3.2.2 HPV16 E5 DNA的測(cè)定

HPV16 E5 DNA的測(cè)定分為以下幾個(gè)步驟：①PCR：擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為20 μl，包括 premix Tag10 μl，primer 0.5 μl，ddH2O 7.5 μl，組織DNA 2 μl。設(shè)置陰性對(duì)照。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃ 9 min，變性95℃ 30 sec，退火58℃ 30 sec，延伸72℃ 15 sec，共40個(gè)循環(huán)，后延伸72℃ 10min。②凝膠電泳：凝膠濃度為2.5%-3%，marker為DL2000，目標(biāo)條帶為108kb，電泳時(shí)電壓為90 v，電泳時(shí)間為30 min。③結(jié)果判斷：陰性對(duì)照無(wú)條帶。樣本處若相應(yīng)位置(108 bp)出現(xiàn)目標(biāo)條帶，則為陽(yáng)性結(jié)果，否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

利用EXCLE2010處理數(shù)據(jù)并建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織樣本中E5基因PCR擴(kuò)增

以組織中提取的DNA為模板，以E5的特異引物進(jìn)行進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR瓊脂糖電泳結(jié)果見(jiàn)圖1(部分結(jié)果)?？梢?jiàn)，陰性結(jié)果無(wú)條帶，陽(yáng)性結(jié)果250 bp與100 bp之間有一明顯條帶，大小與預(yù)期值相符(108 bp)。內(nèi)參β-actin PCR結(jié)果見(jiàn)圖2，片段大小約為132 bp，與預(yù)期值相符。本實(shí)驗(yàn)中每一個(gè)樣品β-actin PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明我們基因組DNA提取是完全成功的。

圖1 PCR產(chǎn)物E5基因的瓊脂糖電泳注：6，11：DNA marker(DL2000)；10：陰性對(duì)照；1，5：PCR陰性結(jié)果；2-4，7-9：PCR陽(yáng)性結(jié)果(108 bp)

圖2 β-actin的瓊脂糖電泳注：1-11：β-actin；12：DNA marker(DL2000)

2.2 不同宮頸病變組織中HPV16E5基因陽(yáng)性率分析

在不同組別HPV16陽(yáng)性的標(biāo)本中檢測(cè)到E5基因的情況可見(jiàn)：宮頸炎中E5基因陽(yáng)性率為58.33%，宮頸癌組中E5基因陽(yáng)性率為77.78%，宮頸癌組中陽(yáng)性率最高，見(jiàn)表1。但經(jīng)SPSS檢驗(yàn)分析，各組間P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HPV16 E5基因并不僅僅在宮頸癌早期表達(dá)。

表1 HPV16 E5DNA在不同病變宮頸組織標(biāo)本中的陽(yáng)性率

3 討論

人乳頭瘤病毒(HPV)有多種基因型，到目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了150多種，與人生殖道感染有關(guān)的有40多種，其中20種與宮頸癌的發(fā)生相關(guān)[9]。根據(jù)致癌危險(xiǎn)性可將HPV分為低危型和高危型。低危型HPV主要引起生殖道濕疣及輕度的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅠ)，高危型HPV主要引起中、重度的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅡ、CINⅢ)和宮頸癌。

HPV16是高危型病毒，其E5基因編碼83個(gè)氨基酸的小蛋白。E5蛋白主要存在于細(xì)胞膜[10]、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜中，有研究提示它主要在感染細(xì)胞的早期繁殖、擴(kuò)張中起重要作用[11]，但近年有研究認(rèn)為E5在晚期腫瘤細(xì)胞中因HPV16基因并非單純整合(還包括游離型與混合型)因此可能同樣存在[5-6]。

Chang等[12]以免疫組化的方法，研究HPV16感染的不同宮頸病變組織發(fā)現(xiàn)，在低級(jí)的CIN和高級(jí)CIN病變組織中均有HPV16E5蛋白的表達(dá)，在侵入性宮頸癌中發(fā)現(xiàn)40%的樣本中E5蛋白表達(dá)。

本研究中，宮頸炎組E5 DNA陽(yáng)性率為58.33%，CINⅠ級(jí)為63.64%，CINⅡ?yàn)?0.00%，CINⅢ級(jí)為44.44%，宮頸癌為77.78%，各組間陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HPV16 E5基因并不僅僅在宮頸癌早期表達(dá)。該研究與我們推測(cè)的E5基因可能僅存在于宮頸病變的早期相反，但與Chang等研究結(jié)果相同，這也與胡家昌[10]等認(rèn)為的晚期腫瘤病例中包括游離型與混合型HPV16，E5在晚期腫瘤細(xì)胞中可能同樣存在的觀點(diǎn)相吻合。E5基因在宮頸病變不同程度中均存在，且在宮頸癌晚期陽(yáng)性率較高，提示我們可將HPV16E5作為宮頸癌疫苗研究的靶點(diǎn)之一。

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12Chang JL, Tsao YP, Liu DW, et al. The expression of HPV-16 E5 protein in squamous neoplastic changes in the uterine cervix[J]. J Biomed Sci, 2001, 8(2): 206-213.

Study on human papillomavirus type 16 E5 gene in different cervical lesions*

Yang Jia-jie1, Cao Zi-xun1,Liang Kai-ru2,ZuoZhuo-chi1, Zuo Feng-qiong2△

(1.Chengdu Shude High School, Sichuan Chengdu 610031;2.Sichuan Maternal and Child Health Hospital, Sichuan Chengdu 6100313;3.West China of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

Objective：To investigate E5 gene of human papilloma virus (HPV)16 in clinical cervicitis, CIN I, CIN II, CIN III and cervical cancer patients;to determine whether HPV16 E5 can be used as early diagnosis target for clinical cervical cancer; to further study the mechanism of carcinogenesis of HPV16. Methods: Sixty-one cases were selected from HPV16 positive specimens which were divided into 5 groups according to the pathological diagnosis (cervicitis group, CIN I, CIN II, CIN III and cervical cancer group). HPV16 E5 DNA was measured by PCR. Results: The positive rate of DNA E5 was 58.33% in cervicitis group, 63.64% in CIN I, 70% in CIN II, 44.44%in CIN III, and 77.78% in cervical cancer. Between groups the positive rate was not statistically significant. Conclusion: DNA E5 not only exists in the early stage of cervical cancer, so E5 cannot be used as a target for early diagnosis of cervical cancer, but it can be used as a target for cervical cancer vaccine research.

Cervical cancer; Human papillomavirus type 16; E5 gene

四川省科技廳基金(編號(hào)：2012JY0017)

楊嘉潔，女，成都樹(shù)德中學(xué)高2015級(jí)學(xué)生，Email：397480785@qq.com。

△通訊作者：左鳳瓊，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教學(xué)及科研工作，Email：497465261@qq.com。

2016-11-1)