角蒿咖啡酸酯對(duì)小鼠耳腫脹的抑制作用

黎 麗，李玉珍，丁利平，黃 鐘

1) 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳 518060； 2) 中山大學(xué)第八附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東深圳518033

【生物工程 / Bioengineering】

角蒿咖啡酸酯對(duì)小鼠耳腫脹的抑制作用

黎 麗1，2，李玉珍2，丁利平1，黃 鐘1

1) 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳 518060； 2) 中山大學(xué)第八附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東深圳518033

研究了角蒿咖啡酸酯((+)-2-(1-hydroxyl-4-oxocyclohexyl) ethyl caffeate， JH2)對(duì)花生四烯酸(arachidonic acid, AA)致小鼠耳腫脹的抑制作用，探討其作用機(jī)制，采用花生四烯酸誘導(dǎo)的小鼠急性耳腫脹模型評(píng)價(jià)JH2的體內(nèi)藥效，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JH2對(duì)AA通路中5-脂氧合酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)活性的影響．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在AA誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型中，JH2能顯著抑制AA所致的小鼠耳腫脹程度和組織蛋白滲出量，并降低小鼠發(fā)炎耳組織中白三烯B4(leukotrienes B4, LTB4) 的生成量．體外活性研究顯示，JH2對(duì)5-LOX有較強(qiáng)的抑制活性，半抑制濃度IC50值為12.16 μmol/L．說明JH2對(duì)AA誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹急性炎癥具有抑制作用，其作用機(jī)制可能與JH2抑制AA通路中5-LOX的活性從而降低炎癥介質(zhì)LTB4的產(chǎn)生有關(guān)．

藥理學(xué)；耳腫脹；角蒿咖啡酸酯；花生四烯酸；5-脂氧酶；白三烯B4

紫葳科(Bignoniaceae)角蒿屬(Incarvillea Juss)植物大花雞肉參Incarvillea mairei var.granditlora (Wehrhahn) Grierson的干燥全草，在中國(guó)華南和西南地區(qū)被作為一種傳統(tǒng)的民間藥材應(yīng)用，具有抗炎鎮(zhèn)痛、清熱解毒和祛風(fēng)除濕等功效[1-2]．目前，有關(guān)大花雞肉參藥材或原植物的植物化學(xué)、藥理學(xué)、化學(xué)生物學(xué)或生藥學(xué)方面的詳細(xì)報(bào)道還很少見．為研究大花雞肉參的中醫(yī)功效和生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，本文利用該種植物資源開發(fā)高療效、低毒副作用的新一類抗炎天然藥物，從該植物中分離得到的化合物(+)-2-(1-羥基-4-環(huán)己酮)乙基咖啡酸酯[3]((+)-2-(1-Hydroxyl-4-oxocyclohexyl) ethyl caffeate，JH2)， 深入研究JH2對(duì)花生四烯酸(arachidonic acid, AA)誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹的抑制作用，初步探討其作用機(jī)制，以對(duì)JH2的臨床研究提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

5-脂氧酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)、脂氧化酶抑制劑篩選試劑盒和白三烯B4(leukotrienes B4, LTB4) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Cayman 公司；伊文思藍(lán)染料、丙酮、甲酰胺溶液、體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林溶液、蘇木精-伊紅( hematoxylin-eosin staining, H&E) 染料、0.22 μm濾膜、直徑6 mm打孔器和游標(biāo)卡尺均購(gòu)自深圳博興生物科技有限公司；Hettich 32R 離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；ELx800通用酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)．

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性ICR小鼠體質(zhì)量為18～20 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心．動(dòng)物室溫控制在 25 ℃左右，可任意進(jìn)食飲水．遵循國(guó)際公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范，科學(xué)、合理地進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)．

1.3 小鼠耳腫脹模型造模

根據(jù)文獻(xiàn)[4-6]的方法，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)配制體積分?jǐn)?shù)為0.5%的依文斯藍(lán)溶液，用0.20 μm濾膜過濾除菌．雄性ICR小鼠24只隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為模型組，給藥高、中、低劑量組．造模前，為了測(cè)定蛋白滲出量，先將所有的實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈注射0.20 mL依文斯藍(lán)溶液．依據(jù)分組，將所有實(shí)驗(yàn)小鼠右耳耳廓正反兩面涂抹20.0 μL質(zhì)量濃度分別為62.50、125.00和250.00 mg/mL的JH2，即實(shí)驗(yàn)小鼠分組Ⅰ為模型組，Ⅱ?yàn)镴H2低劑量組(1.25 mg/耳)，Ⅲ為JH2中劑量組(2.50 mg/耳)，Ⅳ為JH2高劑量組(5.00 mg/耳)．30 min后，將所有小鼠右耳耳廓正反面涂20.00 μL AA(ρ(AA)=100 mg/mL溶于丙酮)造模，1 h后，擦除實(shí)驗(yàn)小鼠耳朵殘留物，檢測(cè)小鼠的耳腫脹各項(xiàng)指標(biāo)．

1.4 耳腫脹度的測(cè)量

AA刺激1 h后，小鼠頸椎脫臼處死，剪下雙側(cè)耳朵，用直徑6 mm打孔器雙側(cè)同樣位置打孔，立即用電子天平稱量耳片質(zhì)量，且用游標(biāo)卡尺測(cè)量耳片厚度．小鼠耳腫脹程度用每只小鼠同位置同面積耳片的質(zhì)量差(mR-mL)和厚度差(dR-dL)來評(píng)價(jià)．其中， mR和dR為發(fā)炎右耳片的質(zhì)量及厚度； mL和dL為未發(fā)炎左耳片的質(zhì)量及厚度．

1.5 蛋白滲出量的檢測(cè)

AA刺激1 h后，小鼠頸椎脫臼處死，剪下雙側(cè)耳朵，用直徑 6 mm打孔器雙側(cè)同樣位置打孔，耳片放在對(duì)應(yīng)的EP管中，加入1 mL酰胺，置于55 ℃水浴中充分震蕩24 h后，在酶標(biāo)儀610 nm波長(zhǎng)處測(cè)量光密度值(optical density, OD)，記作D(610)． 耳組織染料滲出液的變化為D(610)R-D(610)L．

1.6 JH2對(duì)小鼠腫脹耳片中LTB4含量測(cè)定

將耳片放在EP管中，液氮研碎，加入500 μL乙醇震蕩混勻后12 000 r/min離心取上清，用LTB4ELISA試劑盒檢測(cè)LTB4的含量．

1.7 組織病理學(xué)分析

先將小鼠耳片完整剪下，用體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林溶液固定．耳片脫水后石蠟包埋，切片機(jī)接近耳根部位切片，進(jìn)行H&E染色．50×光學(xué)顯微鏡下拍片，觀察小鼠耳腫脹程度和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)聚集情況．

1.8 JH2對(duì)5-LOX活性的影響

通過ELISA方法和脂氧化酶抑制劑篩選試劑盒，測(cè)定JH2對(duì)5-LOX的酶活性的抑制作用強(qiáng)弱[7]．在96 孔板內(nèi)，空白對(duì)照組加入50.00 μL反應(yīng)緩沖液，100%純酶活性組加入49.50 μL 5-LOX純酶稀釋液和 0.50 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，給藥組加入49.50 μL 5-LOX純酶稀釋液和0.50 μL溶于DMSO的JH2的溶液，使JH2的終濃度依次為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25和3.12 μmol/L；陽性藥5-LOX齊留通JH2的終濃度為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25和3.12 μmol/L；然后，每孔加入5 μL底物亞麻酸，25 ℃震蕩孵育 5 min后，加入顯色劑色原酮50.00 μL/孔，25 ℃震蕩孵育 5 min后終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)D(490)值，計(jì)算抑制率為

(1)

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果及分析

2.1 JH2對(duì) AA致小鼠耳腫脹度的影響

以耳朵局部涂抹給藥方式評(píng)價(jià)JH2 對(duì)小鼠耳腫脹的作用，結(jié)果表明，局部涂AA能引起耳朵發(fā)紅、腫脹．與模型組相比， JH2可以明顯減少小鼠耳質(zhì)量差(表 1)及厚度差(表 2)，并呈一定量效關(guān)系，說明JH2 對(duì)耳腫脹程度有明顯抑制作用．

組別mL/mgmR/mg(mR-mL)/mg抑制率/%Ⅰ10．90±0．5022．80±2．1011．80±1．600．00Ⅱ11．40±1．0020．50±1．509．00±1．3023．72Ⅲ10．60±0．6016．60±3．201)5．90±0．801)49．58Ⅳ11．10±0．9014．70±2．402)3．60±0．802)69．49

1)表示與模型組比較P<0. 05；2)表示與模型組比較P<0. 01

組別dL/mmdR/mm(dR-dL)/mm抑制率/%Ⅰ0．14±0．010．65±0．030．51±0．04Ⅱ0．16±0．010．56±0．030．40±0．0219．22Ⅲ0．14±0．010．43±0．021)0．29±0．041)43．14Ⅳ0．15±0．010．28±0．032)0．14±0．022)72．55

1)表示與模型組比較P<0.05；2)表示與模型組比較P<0.01

2.2 JH2對(duì) AA致小鼠蛋白滲出量的影響

蛋白滲出量以伊文思藍(lán)染料滲出量表示．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，JH2能顯著抑制小鼠腫脹耳朵的染料滲出，處理時(shí)1.25、2.50和5.00 mg/耳的抑制率分別為22.13%、41.50%和60.66%，見圖1．

2.3 JH2對(duì)耳腫脹小鼠耳中LTB4生成量影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，局部涂AA能引起LTB4生成量顯著升高．JH2能顯著抑制LTB4生成量，1.25、2.50和5.00 mg/耳處理后的抑制率分別為65.63%、81.25%和87.50%，見圖2．

2.4 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

在50×光學(xué)顯微鏡下觀察，耳組織病理切片結(jié)果如圖3．由圖3可見，模型組AA刺激的耳朵出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，膠原纖維間隙增大，但炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象不明顯．JH2處理組耳朵厚度較對(duì)照組明顯有所減小，水腫程度降低．

**表示與模型組比較P< 0. 01；***表示與模型組比較P<0. 001圖1 JH2對(duì) AA致小鼠蛋白滲出量的影響Fig.1 Effects of JH2 on exudation of proteins

***表示與模型組比較P<0. 001圖2 JH2對(duì) LTB4生成量的影響Fig.2 Effects of JH2 on LTB4 generation

圖3 組織病理學(xué)檢查結(jié)果(H&E染色)Fig.3 (Color online) Representative H&E-stained sections of ear biopsies

2.5 JH2對(duì)花生AA代謝通路關(guān)鍵酶5-LOX的影響

為研究JH2對(duì)5-LOX的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)就JH2對(duì)AA通路中關(guān)鍵酶5-LOX以及COX-2的活性影響進(jìn)行了檢測(cè)．結(jié)果顯示，JH2對(duì)5-LOX的酶活性有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其半數(shù)抑制濃度IC50值為12.16 μmol/L，與陽性藥Zuleution活性接近(IC50=10.51 μmol/L)，見圖4．JH2對(duì)COX-2無明顯抑制作用．

圖4 JH2及Zileution對(duì)5-LOX酶活性的影響Fig.4 Effect of JH2 and Zileution on 5-LOX activity

3 討 論

炎癥是機(jī)體對(duì)外界刺激作出反應(yīng)、對(duì)局部組織或器官的損傷進(jìn)行修復(fù)的生理過程，是多種疾病中最常見而又最復(fù)雜的病理過程[9]．很多炎癥介質(zhì)在機(jī)體內(nèi)主要由AA代謝產(chǎn)生，其中，5-LOX是AA代謝通路中強(qiáng)效致炎因子LTB4合成途徑的關(guān)鍵限速酶．AA在PLA2和5-LOX等酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)TA4，LTA4后者被LTA4H水解為L(zhǎng)TB4．LTB4是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的炎癥趨化介質(zhì)之一，也是一種炎癥性疼痛的介質(zhì)．所以LTA4H可以作為很重要的抗炎靶點(diǎn)．化合物對(duì)LTA4H的影響可以通過對(duì)產(chǎn)物 LTB4的測(cè)定來判斷藥物對(duì)純化酶的抑制作用強(qiáng)弱[10-12]．因此研究開發(fā)5-LOX及其代謝產(chǎn)物L(fēng)TB4的小分子抑制劑，對(duì)多種急慢性炎癥的治療具有重要意義．

本研究首先采用AA誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型，對(duì)JH2的整體抗炎藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)JH2能夠通過顯著抑制AA所致的小鼠耳腫脹厚度、蛋白滲出量，并降低小鼠發(fā)炎耳組織中LTB4的產(chǎn)生量，從而改善AA誘導(dǎo)的耳腫脹炎癥．研究初步探討了其作用機(jī)制，進(jìn)一步證明了JH2能夠抑制AA代謝通路中的關(guān)鍵酶5-LOX的活性．因而說明JH2對(duì)AA誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹急性炎癥具有抑制作用，其機(jī)制可能是通過抑制AA代謝通路中的關(guān)鍵酶5-LOX的活性，從而減少炎癥介質(zhì)LTB4的生成而發(fā)揮抗炎作用．本研究證明了JH2是一種具有良好抗炎藥效的天然小分子化合物，可作為開發(fā)5-LOX抑制劑抗炎藥物的先導(dǎo)化合物，具有深入研究開發(fā)的價(jià)值．

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【中文責(zé)編：晨 兮；英文責(zé)編：艾 琳】

Effect ofIncarvilleacaffeate on mouse ear edema

Li Li1, 2, Li Yuzhen2?, Ding Liping1?, and Huang Zhong1

1) School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China 2) Department of Pharmacy, The Eighth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Shenzhen 518033, Guangdong Province, P.R.China

We investigated the effect of Incarvillea caffeate ((+)-2-(1-hydroxyl-4-oxocyclohexyl) ethyl caffeate, JH2) on arachidonic acid (AA) and its possible mechanism. We used AA-induced mouse acute ear edema model to determine the effect of JH2 on in vivo. We also studied the effect of JH2 on the enzyme activities of 5-lipoxygenase (5-LOX) by ELISA. The results showed that topical treatment with JH2 markedly inhibits the extent of oedema and protein permeability. Importantly, leukotrienes B4(LTB4) production in ear mouse is also drastically suppressed by JH2 and reaches a maximum inhibition rate of 87.50%. Activity assay in vitro showed that JH2 inhibits 5-LOX activity with half maximal inhibitory concentration (IC50) of 12.16 μmol/L. JH2 presents anti-inflammatory effect on AA-induced mouse acute ear edema model through controlling the excessive production of LTB4by inhibiting the activity of 5-LOX.

pharmacology; ear edema; Incarvillea caffeate; arachidonic acid (AA); 5-lipoxygenase (5-LOX); leukotrienes B4(LTB4)

Received：2016-07-07；Accepted：2016-07-12

Foundation：Postdoctoral Science Foundation of China (2015M572370)

? Corresponding author：Chief physician Li Yuzhen. E-mail: 695768596@qq.com; Postdoctoral Ding Liping. E-mail: 13552432187@163.com

：Li Li, Li Yuzhen, Ding Liping, et al. Effect of Incarvillea caffeate on mouse ear edema[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(1): 46-50.(in Chinese)

R 392

A

10.3724/SP.J.1249.2017.01046

中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015M572370)

黎 麗 (1986—)，女，深圳大學(xué)博士后研究人員. 研究方向：天然產(chǎn)物機(jī)制研究.E-mail: wlili19860318123@163.com

引 文：黎 麗，李玉珍，丁利平，等. 角蒿咖啡酸酯對(duì)小鼠耳腫脹的抑制作用[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2017，34(1)：46-50.