基于iTRAQ技術(shù)分析兩個(gè)不同生態(tài)區(qū)煙草葉片蛋白組的表達(dá)差異

雷波，秦嘉，廖成松，趙會(huì)納，丁福章，任竹，郭玉雙，潘文杰

（1.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)山地烤煙品質(zhì)與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550081；2.重慶文理學(xué)院，重慶402160）

基于iTRAQ技術(shù)分析兩個(gè)不同生態(tài)區(qū)煙草葉片蛋白組的表達(dá)差異

雷波1，秦嘉2，廖成松1，趙會(huì)納1，丁福章1，任竹1，郭玉雙1，潘文杰1

（1.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)山地烤煙品質(zhì)與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550081；2.重慶文理學(xué)院，重慶402160）

種植在不同生態(tài)區(qū)的煙草具有不同的香型。但香型物質(zhì)形成在蛋白組水平的分子機(jī)制尚不清楚。本研究用基團(tuán)標(biāo)記技術(shù)（iTRAQ）對(duì)種植在兩個(gè)不同生態(tài)區(qū)的煙草主要生育時(shí)期葉片中蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行定量研究及生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：在鑒定到的2005個(gè)蛋白中，有291個(gè)在兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙草4個(gè)重要生長(zhǎng)發(fā)育期葉片中的表達(dá)有顯著差異，團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期和生理成熟期差異表達(dá)蛋白的數(shù)目分別為：64、65、90、72。這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要位于細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞組分以及細(xì)胞器中，主要參與代謝過(guò)程、細(xì)胞組成以及對(duì)外界刺激的應(yīng)激過(guò)程；參與光合作用、次生代謝途徑的蛋白質(zhì)在兩個(gè)生態(tài)區(qū)的生理成熟期煙葉中的表達(dá)差異顯著。這暗示不同生態(tài)區(qū)的煙草葉片蛋白組表達(dá)模式不同，參與光合作用和次生代謝物質(zhì)生物合成相關(guān)蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，導(dǎo)致不同生態(tài)區(qū)的煙葉中形成不同的香型物質(zhì)。

不同生態(tài)區(qū)；iTRAQ；葉片蛋白組；煙草

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其品質(zhì)形成與生態(tài)因素、品種和栽培技術(shù)相關(guān)。其中，生態(tài)因素對(duì)煙葉品質(zhì)和風(fēng)味特色影響最大[1、2]。生態(tài)因素如溫度、水分、光照、大氣、養(yǎng)分等都會(huì)對(duì)煙草的生長(zhǎng)產(chǎn)生各種各樣的影響，對(duì)煙草自身基因的mRNA表達(dá)和調(diào)控的影響導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平的變化，進(jìn)而在更高水平上導(dǎo)致次生代謝物質(zhì)、生理指標(biāo)以及形態(tài)結(jié)構(gòu)上的變化，最終影響煙葉的品質(zhì)和特色。

受限于檢測(cè)技術(shù)，生態(tài)因素對(duì)煙葉生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)的影響主要集中于基因表達(dá)量和初烤煙葉化學(xué)成分的研究，在蛋白質(zhì)水平研究較少。Matsuoka等對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期煙草基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析[3]。汪耀富等對(duì)滲透脅迫下煙草葉片基因的差異表達(dá)進(jìn)行了研究，鑒定出了135個(gè)與防御和滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的基因[4]。Lei等利用基因芯片技術(shù)比較不同生態(tài)區(qū)煙葉基因表達(dá)譜和代謝產(chǎn)物，鑒定了與煙葉香氣形成相關(guān)的基因[5]。崔紅等應(yīng)用蛋白質(zhì)雙向電泳聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)煙草葉片蛋白質(zhì)組成進(jìn)行了比較研究，鑒定出了25種表達(dá)量上升的蛋白質(zhì)[6]。

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification,iTRAQ）技術(shù)是2004年由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司開(kāi)發(fā)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，具有定量精度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，該技術(shù)已在少數(shù)植物中得到應(yīng)用[7]。前人研究表明生態(tài)環(huán)境決定煙葉特色，不同生態(tài)區(qū)種植煙葉具有不同香型[8]，但香氣物質(zhì)形成的分子機(jī)制尚不明確，特別是蛋白質(zhì)水平的分子機(jī)制還不清楚。本研究采用iTRAQ技術(shù)比較種植在云南省江川（傳統(tǒng)典型清香型）和貴州省遵義（傳統(tǒng)典型中間香型）烤煙品種K326的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的4個(gè)關(guān)鍵生育期（團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期和生理成熟期）第11葉位煙葉蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異，采用生物信息學(xué)分析差異蛋白的功能，探討生態(tài)環(huán)境影響煙葉香型物質(zhì)形成的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究供試材料為烤煙品種K326，于2012年分別種植于貴州省遵義市播州區(qū)（簡(jiǎn)稱“ZY”），東經(jīng)106°17′22＂～107°26′25＂，北緯27°13′15＂～28°04′09＂，海拔1 000 m；云南省江川縣（簡(jiǎn)稱“JC”），東經(jīng)102°45′，北緯24°17′，海拔1 730 m；栽培措施按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)規(guī)程進(jìn)行。在田間選擇發(fā)育良好的煙株掛牌標(biāo)記，每個(gè)生態(tài)點(diǎn)選擇20株。分別在團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期和生理成熟期分4次采集新鮮煙葉（第11葉位）樣品，每次每個(gè)生態(tài)區(qū)采集20片葉子，將葉片去掉基部和尖部，保留葉片中部，迅速放入液氮中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 煙葉蛋白質(zhì)的提取

稱取適量的煙葉樣品，加入500 μL蛋白裂解液溶解，然后分別添加終濃度為1 mmol·L-1的PMSF，2 mmol·L-1的EDTA，5 min后，添加終濃度為10 mmol·L-1的DTT；超聲溶解15 min，然后25 000 g離心20 min，取上清；上清液在56℃條件下加入終濃度為10 mmol·L-1DTT處理1 h，還原打開(kāi)二硫鍵；再加入終濃度為55 mmol·L-1IAM，暗室靜置45 min，進(jìn)行半胱氨酸的烷基化封閉；隨后，加入適量冷丙酮，在-20℃靜置2 h，然后25 000 g離心20 min，丟棄上清液；沉淀在200 μL 0.5 mol·L-1TEAB中超聲溶解15 min；最后，25 000 g離心20 min后取上清液用于定量。采用Bradford定量技術(shù)對(duì)煙葉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，利用12%SDS電泳檢測(cè)所提取的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

1.3 煙葉蛋白質(zhì)iTRAQ標(biāo)記、肽段分離及鑒定

取兩個(gè)生態(tài)區(qū)4個(gè)不同發(fā)育階段煙葉蛋白各100 μg，按照蛋白∶胰蛋白酶=20∶1比例酶解12 h以上。采用真空冷凍干燥酶解液，用30 μL 0.5 mol·L-1TEAB復(fù)溶肽段。采用8標(biāo)iTRAQ試劑進(jìn)行樣品標(biāo)記，將標(biāo)記后的各組肽段混合，用SCX柱進(jìn)行液相分離。其中JC 4個(gè)時(shí)期（團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期和生理成熟期）煙葉樣品分別用113、114、115和116標(biāo)記，ZY 4個(gè)時(shí)期（團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期和生理成熟）煙葉樣品分別用117、118、119和121標(biāo)記。將標(biāo)記后抽干的混合肽段用4 mL緩沖液A（25 mmol·L-1NaH2PO4溶于25%ACN中，pH2.7）復(fù)溶。進(jìn)柱后以1 mL·min-1的速率進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)過(guò)篩選得到12個(gè)組分。每個(gè)組分分別用Strata X除鹽柱除鹽，然后冷凍抽干。將抽干的每個(gè)組分分別用緩沖液A（5%ACN、0.1%FA）復(fù)溶至約0.5 μg·μL-1的濃度，20 000 g離心10 min，除去不溶物質(zhì)。每個(gè)組分上樣8 μL（約4μg蛋白），通過(guò)島津公司LC-20AD型納升液相色譜儀進(jìn)行分離。分離程序如下：先以8 μL·min-1的流速進(jìn)樣4 min；然后用洗滌緩沖液B（95%ACN、0.1%FA）以0.3 μL·min-1的流速梯度洗滌40 min，濃度梯度從2%上升到35%；再?gòu)?5%到80%線性洗滌5 min。最后用80%的緩沖液B洗柱4 min，緩沖液A洗柱1 min。

經(jīng)過(guò)液相分離的肽段進(jìn)入串聯(lián)ESI質(zhì)譜儀：Q-EXACTIVE（ThermoFisher Scientific，San Jose，CA)。一級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)置為70 000（質(zhì)荷比/半峰寬）。用碰撞能量為27（±12%）的HCD（High energy Collision Dissociation）模式對(duì)肽段進(jìn)行篩選，二級(jí)碎片在Orbi中檢測(cè)，分辨率為17 500。每個(gè)峰強(qiáng)度超過(guò)20 000的一級(jí)母離子打15個(gè)二級(jí)譜圖，一級(jí)掃描和二級(jí)掃描交替進(jìn)行。動(dòng)態(tài)排除設(shè)定為：15秒相同的母離子打二級(jí)不會(huì)超過(guò)2次。離子源電壓設(shè)置為1.6 kV。AGC（Automatic Gain Control）通過(guò)Orbi來(lái)實(shí)現(xiàn)，其設(shè)置為：對(duì)Orbi內(nèi)控制聚集量在3e-6～1e-5之間的離子進(jìn)行二級(jí)掃描鑒定，掃描的質(zhì)荷比范圍為350～2 000。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載名稱為：Nicotiana_benthamiana、Nicotiana_sylvestris、Nicotiana_tabacum的所有蛋白序列共106 856序列到本地磁盤(pán)構(gòu)建新的數(shù)據(jù)庫(kù)備用。

1.4.2 MASCOT搜索

使用Mascot 2.3.02在質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸出結(jié)果搜索上述數(shù)據(jù)庫(kù)，操作時(shí)以mgf文件為原始文件。Mascot搜索參數(shù)設(shè)置如下：Type of search:MS/MS Ion；Enzyme:Trypsin；Fragment Mass Tolerance：±0.02 Da；Mass Values:Monoisotopic；Variable modifications:Gln-＞pyro-Glu(N-term Q)，Oxidation(M)，iTRAQ8plex(Y)；Peptide Mass Tolerance：±15 ppm；Instrument type:Default；Max Missed Cleavages:1；Fixed modifications: Carbamidomethyl(C)，iTRAQ8plex(N-term)，iTRAQ8plex(K)；Protein Mass:Unrestricted。

1.4.3 生物信息學(xué)分析

將ZY和JC的同一生育期煙葉樣品蛋白組進(jìn)行兩兩比較，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)豐度水平差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P-value值小于0.05時(shí)，視為差異蛋白。差異蛋白進(jìn)行Gene Ontology分析（簡(jiǎn)稱GO分析）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway分析[9、10]。

2 結(jié)果

2.1兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉中蛋白質(zhì)的鑒定

兩個(gè)生態(tài)區(qū)4個(gè)關(guān)鍵發(fā)育期共8個(gè)樣品檢測(cè)到二級(jí)譜圖總數(shù)為150 913，其中匹配到特有肽段的譜圖數(shù)量為7 200；對(duì)應(yīng)的總肽段數(shù)為4 939，其中鑒定到特有肽段序列的數(shù)量為4 110。經(jīng)Mascot軟件比對(duì)Nicotiana_benthamiana、Nicotiana_sylvestris、Nicotiana_tabacum的所有106 856個(gè)蛋白序列構(gòu)成的本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)后，獲得2 005種蛋白質(zhì)。鑒定到的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在10～70 kDa，其中相對(duì)分子質(zhì)量介于30～40 kDa的蛋白質(zhì)比例最高，為22.44%，其次是分子量介于20～30 kDa的蛋白質(zhì)，比例為18.50%。從蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度來(lái)看，大部分被鑒定到的蛋白質(zhì)所含的肽段數(shù)量在10個(gè)以內(nèi)，占蛋白質(zhì)總數(shù)的54.91%。

2.2 兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉中蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異

在相對(duì)定量時(shí)，如果同一個(gè)蛋白質(zhì)的量在兩個(gè)樣品間沒(méi)有顯著的差異，那么其蛋白質(zhì)豐度比接近于1。當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P-value值小于0.05時(shí)，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。以JC煙葉為對(duì)照，與團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期和生理成熟期4個(gè)時(shí)期ZY煙葉中蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行比較，兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉4個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)期顯著表達(dá)差異蛋白共計(jì)291個(gè)（圖1）。

圖1 團(tuán)棵期（A）、旺長(zhǎng)期（B）、現(xiàn)蕾期（C）和生理成熟期（D）煙葉蛋白質(zhì)豐度分布注：橫坐標(biāo)表示差異倍數(shù)經(jīng)過(guò)以2為底數(shù)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的值。大于0的為表達(dá)量上調(diào)，小于0的為表達(dá)量下調(diào)。其中差異倍數(shù)大于1.5的點(diǎn)用黑色標(biāo)出，差異倍數(shù)不顯著用灰色標(biāo)出。這些黑色的點(diǎn)可能是潛在的差異蛋白，是否是最終被篩選的差異蛋白，還需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證。Fig.1 The distribution of the fold change of the quantified proteins at rosette stage(A),rapid growth stage(B),budding stage(C),and physiologically maturing stage(D).Notes:the x-axis shows the protein ratio[log(protein ratios),with base=2].A protein ratio of＞0 indicates up-regulation and＜0 indicates down-regulation。The black points perhaps are the differential expressed proteins.Gray indicates no significant change. The differential expression of proteins is defined by both fold change and P-value;however,only fold change is considered here.

與JC煙葉相比，ZY煙葉團(tuán)棵期總共有64個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量呈顯著差異，其中33個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，31個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)；旺長(zhǎng)期有65個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量呈顯著差異，其中28個(gè)表達(dá)上調(diào)，37個(gè)表達(dá)下調(diào)；現(xiàn)蕾期有90個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量呈顯著差異，其中40個(gè)表達(dá)上調(diào)，50個(gè)表達(dá)下調(diào)；生理成熟期有72個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量呈顯著差異，其中表達(dá)上調(diào)的蛋白38個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)34個(gè)（圖2）。

圖24 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)差異蛋白數(shù)目Fig.2The number of differentially expressed proteins at the four different developmental stages examined.

2.3兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能分析

利用GO工具對(duì)兩個(gè)生態(tài)區(qū)291個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了功能富集分析。在生物學(xué)進(jìn)程分類中，兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉差異表達(dá)蛋白主要集中于新陳代謝（30.88%）、細(xì)胞組成（24.99%）和應(yīng)激響應(yīng)（13.59%）。在分子功能分類中，差異表達(dá)蛋白主要集中于酶（45.35%）和結(jié)合蛋白（43.51%）。在所處的細(xì)胞位置分類中，差異表達(dá)蛋白主要集中于細(xì)胞組分（27.24%）、細(xì)胞基質(zhì)（27.24%）和細(xì)胞器（22.55%）。

GO分析表明兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉團(tuán)棵期的64個(gè)差異表達(dá)蛋白可歸于151個(gè)GO分類，在82個(gè)GO分類中差異達(dá)到顯著水平（FDR＜0.05），包括光合系統(tǒng)II、葉綠體囊膜、核糖蛋白復(fù)合體構(gòu)成、離子結(jié)合（金屬離子結(jié)合）、核苷酸結(jié)合、應(yīng)激響應(yīng)、離子運(yùn)輸、激素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等；旺長(zhǎng)期的65個(gè)差異表達(dá)蛋白可歸于135個(gè)GO分類，在43個(gè)GO分類中差異達(dá)到顯著水平（FDR＜0.05），包括氧化還原酶激活、葉綠體囊膜構(gòu)成、大分子結(jié)合、碳—碳酶激活、碳固定、金屬離子響應(yīng)、化學(xué)刺激響應(yīng)、葡萄糖代謝等；現(xiàn)蕾期的90個(gè)差異表達(dá)蛋白可歸于165個(gè)GO分類，在39個(gè)GO分類中差異達(dá)到顯著水平（FDR＜0.05），包括葉綠體囊膜類囊體、光合系統(tǒng)II構(gòu)成、陽(yáng)離子結(jié)合、順式—反式異構(gòu)酶激活、陽(yáng)離子轉(zhuǎn)導(dǎo)等；而生理成熟期的72個(gè)差異表達(dá)蛋白可歸于118個(gè)GO分類，在26個(gè)GO分類中差異達(dá)到顯著水平（FDR＜0.05），包括細(xì)胞外區(qū)域、葉綠體組成、陽(yáng)離子結(jié)合、水解酶活化、葡萄糖苷酶活化、碳水化合物磷酸化酶活化等。

2.4 兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG pathway分析

為了進(jìn)一步了解所檢測(cè)到的差異蛋白的生物學(xué)功能，對(duì)兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了KEGG Pathway分析[10]。兩個(gè)生態(tài)區(qū)的團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期和生理成熟期煙葉差異表達(dá)蛋白分別參與63、50、86和51個(gè)代謝途徑。其中，煙葉發(fā)育的4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期差異表達(dá)蛋白都富集于光合作用和次生代謝途徑，且隨著煙葉的生長(zhǎng)發(fā)育，差異表達(dá)的蛋白中參與次生代謝途徑的蛋白數(shù)量增加。參與次生代謝途徑的差異表達(dá)蛋白詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表14 個(gè)時(shí)期煙葉參與次生代謝途徑的差異表達(dá)蛋白Table 1 Proteins involved in the biosynthetic pathway of secondary metabolites at the four key stages

續(xù)表

3 結(jié)論與討論

植物開(kāi)始生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，外在的生態(tài)環(huán)境因素影響植物體內(nèi)的基因表達(dá)[11]。而基因表達(dá)是實(shí)現(xiàn)基因功能的生物過(guò)程。蛋白質(zhì)是實(shí)現(xiàn)基因功能的最重要產(chǎn)物。在本研究中，291個(gè)蛋白在兩個(gè)生態(tài)區(qū)4個(gè)發(fā)育時(shí)期煙葉中的差異表達(dá)，表明不同生態(tài)區(qū)煙葉在生長(zhǎng)過(guò)程中生態(tài)環(huán)境因素導(dǎo)致其基因表達(dá)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)差異表達(dá)。Lei等的研究同樣表明貴州省不同生態(tài)區(qū)煙葉基因譜表達(dá)變化導(dǎo)致次生代謝物質(zhì)變化，從而影響煙葉的香型[5]。對(duì)其他作物的研究也表明，外部環(huán)境的改變將導(dǎo)致植物內(nèi)在環(huán)境的改變，從而影響其基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而影響它的激素水平和代謝產(chǎn)物[11]。本文和前人的研究表明，煙葉的香型與煙葉中代謝產(chǎn)物相關(guān)[12]。煙葉蛋白質(zhì)差異表達(dá)使得代謝產(chǎn)物不同，最終導(dǎo)致生長(zhǎng)在江川和遵義兩個(gè)生態(tài)區(qū)的煙葉具有不同的香型。

通常從植物開(kāi)始生長(zhǎng)發(fā)育，體內(nèi)的蛋白質(zhì)即開(kāi)始合成。從團(tuán)棵期到旺長(zhǎng)期，第11葉位煙葉形態(tài)并沒(méi)有完全形成。在這個(gè)時(shí)期內(nèi)，葉片的生長(zhǎng)發(fā)育需要大量的蛋白質(zhì)用于葉片發(fā)育細(xì)胞的組成成分[13]。因此，在這段時(shí)間內(nèi)煙葉中蛋白質(zhì)合成代謝水平高，隨著葉片的生長(zhǎng)發(fā)育逐漸開(kāi)始成熟，葉片中蛋白質(zhì)分解代謝開(kāi)始活躍[14、15]。從現(xiàn)蕾期到生理成熟期，煙葉逐漸成熟，蛋白水解酶活性增加，蛋白質(zhì)降解代謝水平增高[14-16]。在本研究中第11葉位煙葉從現(xiàn)蕾期到生理成熟期差異表達(dá)蛋白富集于次生代謝進(jìn)程、細(xì)胞成分和細(xì)胞代謝，差異表達(dá)蛋白與前人研究相符。

單萜類化合物和類胡蘿卜素化合物是茶葉香味物質(zhì)的重要組成成分或前體物，它們以糖苷化合物形式儲(chǔ)存在茶葉中，這些糖苷物質(zhì)在后續(xù)葡萄糖苷水解酶等酶作用下釋放出茶葉香氣物質(zhì)[17、18]。前人的研究表明，K326種植在云南省江川時(shí)是傳統(tǒng)典型性清香型煙葉，而種植在貴州省遵義時(shí)為傳統(tǒng)典型性中間香型煙葉。在本研究中，種植在這兩個(gè)地區(qū)煙葉的差異表達(dá)蛋白質(zhì)顯著富集于次生代謝途徑，并且隨著煙葉成熟，兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉中富集于次生代謝途徑的差異表達(dá)蛋白數(shù)目增加。在煙草中，次生代謝途徑誘導(dǎo)因子，如水楊酸或茉莉酸誘導(dǎo)子能影響次生代謝產(chǎn)物的合成，煙葉中蛋白質(zhì)介導(dǎo)的次生代謝途徑的改變可能會(huì)改變次生代謝物質(zhì)的組成和含量，從而影響煙葉香氣化合物的組成。

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[責(zé)任編輯：和諧]

Comparative iTRAQ Analysis of the Leaf Proteome of Tobacco（Nicotina tabacum L.）Plants Grown in Two Different Ecological Regions

LEI Bo1,QIN Jia2,LIAO Cheng-song1,ZHAO Hui-na1,DING Fu-zhang1, REN Zhu1,GUO Yu-shuang1,PAN Wen-jie1

（1.Upland Flue-Cured Tobacco Quality&Ecology Key Laboratory of China Tobacco of Guizhou Academy of Tobacco Science, Guizhou Guiyang 550081,China;2.Chongqing University of Arts and Sciences,Chongqing 402160,China）

Tobacco plants grown in different ecological regions have different aromas.However,the proteomic mechanism of aromas formation is unknown.In this study,we used iTRAQ to identify differences in the constitutive proteomes of leaves collected from Nicotina tobacum L.plants grown in two typical ecological regions that produce distinct aroma of flue-cured tobaccos.We found that 291 out of a total of 2005 proteins expressions were significantly different between leaves harvested from the two regions in the four key developmental stages.Specifically,the expressions of 64 kinds of proteins in the rosette stage,65 kinds of proteins in the rapid growth stage,90 kinds of proteins in the budding stage,and 72 kinds of proteins in the physiologically maturing stage were different.The differentially expressed proteins mainly occur within the cell membrane,or as cellular components,or in organelles, and are involved in metabolic and cellular processes,and responds to external stimuli.Interestingly,the expression of some proteins involved in photosynthesis and secondary metabolite biosynthesis showed significant differences between leaves harvested from the two regions.These results suggest that the growth of tobacco in different ecological regions will result in different protein expression patterns of tobacco leaves,and that the differences in the expression of proteins involved in photosynthesis and secondary metabolite biosynthesis may largely underlie the differences in aroma.

different ecological regions;iTRAQ;leaf proteome;tobacco

S314；X17

A

096-2347（2016）03-0025-07

10.19478/j.cnki.2096-2347.2016.03.04

2016-05-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360431）；中國(guó)煙草總公司重大專項(xiàng)子課題（TS-02-20110014）。

雷波（1981—），女，四川都江堰人，博士，研究員，主要從事煙草栽培和分子生態(tài)學(xué)研究。E-mail：leibo_1981@163.com