心肌片對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響

袁秋貞，鄭 旭，劉 富，程曉毅，考玉萍

1. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(西安 710003)，2. 陜西省食品藥品檢驗(yàn)所藥理室(西安710000)，3. 西安市碑林區(qū)柏樹林社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(西安710000)，4. 西安市長(zhǎng)安區(qū)醫(yī)院(西安710000)

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心肌片對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響

袁秋貞1，鄭 旭2，劉 富3，程曉毅4，考玉萍1

1. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(西安 710003)，2. 陜西省食品藥品檢驗(yàn)所藥理室(西安710000)，3. 西安市碑林區(qū)柏樹林社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(西安710000)，4. 西安市長(zhǎng)安區(qū)醫(yī)院(西安710000)

目的：觀測(cè)心肌片對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。方法：H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、心肌片低中高劑量組，預(yù)給藥24h后，建立心肌缺血/再灌注損傷( MI/RI) 模型。檢測(cè)細(xì)胞存活率，LDH釋放水平，蛋白印跡法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 Bax，Bcl-2，Caspase-3，Cyt-C蛋白的表達(dá)以及AMPK磷酸化水平。結(jié)果：與模型組比較，心肌片提高細(xì)胞存活率，減少LDH水平，穩(wěn)定線粒體膜電位，減少Bax，Caspase-3以及Cyt-C蛋白的表達(dá)，增加 Bcl-2 蛋白的表達(dá)，提高 Bcl-2/Bax 的比值(P<0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些保護(hù)作用被AMPK抑制劑Compound C取消。結(jié)論：心肌片能減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

心肌缺血/再灌注損傷 (Myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)是目前幾種常用血管再通手術(shù)及預(yù)后所面臨的主要難題之一，其在急性心肌梗死再灌注治療的病理生理過程中起著重要的作用[1]，研究開發(fā)有效防治再灌注損傷的藥物已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡普遍存在于MI/RI過程中，并起主導(dǎo)地位[2]，因此在再灌注前或再灌注期間藥物干預(yù)細(xì)胞凋亡，能夠?qū)I/RI到達(dá)一定的保護(hù)作用。心肌片是陜西中醫(yī)醫(yī)院研制的中藥復(fù)方制劑，于2001年獲得了陜西省食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)文號(hào)，由黨參、薤白、紅花、淫羊藿、丹參等中藥煎制而成，治療心肌缺血等疾病有很好的療效，但其作用機(jī)制不清，不利于更廣泛的應(yīng)用于患者。本實(shí)驗(yàn)研究將心肌片預(yù)給予心肌細(xì)胞，觀察其對(duì)體外實(shí)驗(yàn)性MI/RI的作用，并初步探討其作用機(jī)制。

材料與方法

1 藥物與試劑 心肌片由陜西中醫(yī)醫(yī)院提供；肌鈣蛋白T(cTnT)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)，乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒由南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)提供；Bax，Bcl-2，Caspase-3 和β-actin抗體由Santa Cruz Biotechnology公司提供；AMPK抗體由Cell Signaling Technology (CST)提供；Western Blot相關(guān)試劑盒購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Roche，其他試劑由Sigma公司提供。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及造模 H9c2大鼠心肌細(xì)胞株，購自美國(guó) ATCC 公司(Manassas, VA, USA)，采用含 10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的高糖Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加1%雙抗(鏈霉素-青霉素)后置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞融合度90%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔一天換新鮮培養(yǎng)基。在建立缺血再灌注模型時(shí)，正常培養(yǎng)液更換為PBS緩沖液，在缺氧培養(yǎng)小室充入95% N210min后，放入37℃的恒溫箱中進(jìn)行缺氧4h，然后倒掉PBS緩沖液，重新加入正常培養(yǎng)基，放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h進(jìn)行復(fù)氧。

3 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集H9c2細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104，每孔加入l00ul，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入不同濃度藥液，每孔l00ul，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩l0min，待結(jié)晶物充分溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。存活率=(A測(cè)量-A調(diào)零孔)/(A對(duì)照-A調(diào)零孔)。

4 樣本收集 缺血再灌注后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心后用于測(cè)定LDH和CK-MB含量；收集細(xì)胞，經(jīng)超聲破碎處理、離心收集上清用于測(cè)定Caspase 3, MDA和SOD水平，測(cè)定方法和步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體膜電位 線粒體膜電位的檢測(cè)用熒光染料羅丹明 123，根據(jù)設(shè)計(jì)處理細(xì)胞后，按照試劑盒說明書操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，最后所得結(jié)果用 Cell quest 軟件處理。

6 采用 Western blotting 法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)AMPK和ACC 的表達(dá) 具體步驟如下：裂解緩沖液裂解提取心肌細(xì)胞蛋白，BCA 法蛋白定量后，保存于-70℃?zhèn)溆?。向此蛋白樣品中加入等體積的2×電泳樣品緩沖液，加熱變性，按 30μg 每泳道上樣，經(jīng) 10% SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上。5%的脫脂奶粉封閉常溫下震蕩1h后，加Bcl-2，Bax，AMPK和ACC 單克隆抗體，加用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG，ECL 試劑盒顯影、定影。以β-actin 作內(nèi)參照物。目的條帶積分光密度值和上樣內(nèi)參積分光密度值用Quantity One software (Bio-Rad Laboratories, USA)測(cè)定后，進(jìn)行比較得出相對(duì)光密度值。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用 LSD-t 檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心肌片對(duì)缺血再灌注后 H9c2 細(xì)胞增殖的作用 利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌片對(duì)H9c2細(xì)胞增殖活性的影響。心肌片在低濃度時(shí)，對(duì)心肌細(xì)胞沒有毒性作用，甚至可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，在濃度達(dá)到120 mg/ml以上時(shí)，毒性增加，故選擇20,40和80 mg/ml為作用濃度進(jìn)行以后實(shí)驗(yàn)(圖1A)。與正常組比較，缺血再灌注使H9c2 細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)，而心肌片可以保護(hù)H9c2 細(xì)胞，降低缺血再灌注的損傷程度，并呈濃度依賴關(guān)系(圖1B)。

注： A不同濃度心肌片對(duì)正常H9c2存活率的影響；B 心肌片對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,##P<0.01 比 CON組，**P<0.01 比 I/R組

2 心肌片減輕缺血再灌注損傷 與正常對(duì)照組相比，缺血再灌注顯著升高培養(yǎng)基內(nèi)LDH水平，促進(jìn)了LDH釋放，造成細(xì)胞損傷，而心肌片預(yù)處理組，LDH水平顯著低于缺血再灌注組，且呈劑量依賴關(guān)系(圖2A)。線粒體膜電位的變化可以反映細(xì)胞凋亡或者細(xì)胞損傷情況(圖2B)，缺血再灌注使線粒體膜電位顯著降低，與缺血再灌注組比較，心肌片預(yù)處理使線粒體膜電位顯著升高，表明其可以穩(wěn)定線粒體膜電位。

注:A 心肌片對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中LDH水平的影響；B心肌片對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響,##P<0.01 比 sham組，**P<0.01 比模型組

圖2 心肌片減輕缺血再灌注損傷

3 心肌片減輕缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡 Caspase 家族的激活與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。為了測(cè)試缺血再灌注是否激活 Caspase-3，我們檢測(cè)了Cleaved-caspase 3表達(dá)情況。如圖3A所示，與正常組比較，缺血再灌注誘導(dǎo)的Cleaved-caspase 3顯著增加；心肌片預(yù)處理使Cleaved-caspase 3表達(dá)水平顯著降低，并呈劑量依賴關(guān)系。

細(xì)胞凋亡的線粒體途徑通過 Bcl-2 家族蛋白調(diào)控，具有顯著調(diào)節(jié)線粒體釋放 Cyt-C以及 Caspase-3等 Caspase 家族蛋白的作用。本實(shí)驗(yàn)中，缺血再灌注使細(xì)胞內(nèi)Cyt-C水平顯著升高，而心肌片劑量依賴性的降低了其水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，心肌片可以調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例，穩(wěn)定缺血再灌注造成的Bcl-2/Bax表達(dá)失衡，從而減輕細(xì)胞凋亡(圖3B)。

注：A心肌片對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞內(nèi)Cleaved-caspase 3和Cyt-C水平的影響；B心肌片對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞

4 心肌片對(duì)AMPK信號(hào)通路調(diào)控作用 Western Blot 結(jié)果如圖4 A所示，與對(duì)照組比較，缺血再灌注組P-AMPK/AMPK水平顯著降低，而心肌片預(yù)處理使P-AMPK/AMPK水平呈劑量依賴性增加，說明心肌片可以激活A(yù)MPK信號(hào)通路。心肌片可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注引起的細(xì)胞存活率下降和線粒體凋亡途徑激活，而這些保護(hù)作用均被AMPK抑制劑Compound C抵消(圖4B和圖4C)。

注：A心肌片對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞內(nèi)AMPK磷酸化水平的影響；用AMPK抑制劑Compound C(1μmol/L)抑制AMPK后觀察心肌片對(duì)細(xì)胞

缺血/再灌注損傷(Ischemia/reperfusion injury, I/RI) 是指細(xì)胞因缺血發(fā)生可逆性、可存活的損傷，在再灌注后這種損傷反而加重并引起細(xì)胞死亡或進(jìn)一步的功能障礙，此概念由Hearse在1977年首次提出[3]。近年已有大量實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡可能是心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一[4]。梗死灶周邊區(qū)域的心肌細(xì)胞凋亡擴(kuò)大了梗死面積，促進(jìn)心室重構(gòu)，對(duì)心肌功能產(chǎn)生不利影響。因此有效地抑制再灌注心肌細(xì)胞的凋亡不僅可以減緩心肌細(xì)胞壞死的發(fā)生，更可以挽救大量瀕死細(xì)胞，對(duì)于不可再生的心肌細(xì)胞具有重要臨床意義。

近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥能夠有效地保護(hù)再灌注缺血心肌[5,6]，本研究所用心肌片是由陜西中醫(yī)醫(yī)院研制而成，用于心肌缺血，病毒性心肌炎等有很好的療效。其成分黨參、薤白、紅花、淫羊藿、丹參等已有大量研究報(bào)道具有心肌保護(hù)作用[7-9]，而心肌片的藥理學(xué)作用及其作用機(jī)制未見報(bào)道，影響其推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過建立心肌細(xì)胞缺血再灌注模型，檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率、LDH釋放量等損傷性指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌片預(yù)處理可以提高細(xì)胞存活率，減少LDH釋放，表明心肌片具有保護(hù)心肌缺血再灌注損傷作用。

本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，心肌片對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡也有很好的抑制作用，且能穩(wěn)定缺血再灌注心肌線粒體膜電位。并發(fā)現(xiàn)心肌片對(duì)缺血再灌注心肌 Clevead-caspase-3 和細(xì)胞色素C活性升高有很好的抑制作用，而Clevead-caspase-3 和細(xì)胞色素C活性升高也是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要因素。另外還發(fā)現(xiàn)，心肌片能夠增加 Bcl-2 蛋白、減少 Bax蛋白表達(dá)，提高 Bcl-2 /Bax 比值，體現(xiàn)出心肌片對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

我們進(jìn)一步闡述了心肌片保護(hù)心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷，抗細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種在細(xì)胞內(nèi)行使能量代謝調(diào)節(jié)的蛋白激酶，在全身能量平衡、血糖穩(wěn)定、調(diào)節(jié)脂代謝方面起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，此外，研究發(fā)現(xiàn)AMPK抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)缺血后心功能恢復(fù)，減少心肌梗死面積發(fā)揮保護(hù)缺血/再灌注心臟的作用[10]。在本研究中，心肌片可以劑量依賴性的激活A(yù)MPK，并且采用AMPK特異性抑制劑Compound C抑制AMPK活性后，心肌片的心肌保護(hù)作用消失，說明心肌片通過AMPK信號(hào)通路發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，心肌片能減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡，具有心肌保護(hù)作用，尤其是心肌片高劑量組作用明顯，其機(jī)制可能通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路，從而上調(diào)Bcl-2，下調(diào) Bax，Cyt-C及 Caspase-3 蛋白表達(dá)，升高 Bcl-2 /Bax 比值有關(guān)。

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(收稿：2016-08-16)

心肌缺血/中醫(yī)藥療法 @心肌片 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 大鼠

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10.3969/j.issn.1000-7369.2017.01.062