基于液體發(fā)酵靈芝草烏相互作用的影響研究

王身艷， 陳建偉， 薛 峰， 王娟紅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210023)

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基于液體發(fā)酵靈芝草烏相互作用的影響研究

王身艷， 陳建偉， 薛 峰， 王娟紅*

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210023)

[目的]研究在液體發(fā)酵過程中草烏與靈芝相互作用的影響。[方法]研究在靈芝液體發(fā)酵過程中初始pH、草烏粉及草烏提取物對靈芝菌體生長、胞內(nèi)外多糖的影響，以及靈芝發(fā)酵對草烏粉及草烏提取物中酯型生物堿質(zhì)量分數(shù)的影響。[結(jié)果]當初始pH為6時，靈芝菌體生物量及胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量均達最大值，分別為7.50、0.25、0.42 g/L；草烏粉添加量為20 g/L時，生物量和胞內(nèi)多糖達最大，分別為10.60和0.54 g/L，分別為對照的1.96和2.57倍；草烏粉添加量為15 g/L時，胞外多糖產(chǎn)量達最大，為0.76 g/L，是對照的2.11倍；草烏提取物添加量為0.87 g/L時，生物量和胞外多糖產(chǎn)量達最大，分別為11.30和0.72 g/L，分別是對照的2.13和2.06倍，添加量為1.16 g/L時，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最高，達0.57 g/L，是對照的2.38倍。[結(jié)論]靈芝均能降低發(fā)酵液中草烏粉、草烏提取物中的雙酯型生物堿含量及增加發(fā)酵液中單酯型生物堿含量。

靈芝；草烏；生物堿；多糖；生物量

靈芝(Ganodermalucidum)具有補氣安神、止咳平喘、延年益壽等功效，是藥食兩用的高等藥用真菌。靈芝含有多種成分，多糖是主要藥效成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、延緩衰老、降血脂等功效[1-4]。草烏為毛茛科植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)的干燥塊根，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效，臨床多治療用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛等各種痛癥，且不具有成癮性?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，草烏具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、麻醉止痛等作用[5-6]，其主要活性成分是烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿等生物堿類成分，同時也是其毒性成分，臨床上都使用草烏炮制品。近年來有研究表明，在真菌培養(yǎng)基中添加適量的中藥[7]，可促進真菌菌體生長或提高活性成分含量，也可以有效地提高中藥療效或降低毒性[8]，但中藥和真菌相互影響的研究較少。王身艷等[9-11]前期研究表明，真菌固體發(fā)酵草烏和川烏后，其毒性成分降低，療效提高。該試驗將研究草烏粉和草烏總生物堿經(jīng)靈芝液體發(fā)酵后，其生物堿相對含量的變化以及草烏對靈芝多糖和菌體生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。電子天平(HX1002T慈溪市天東衡器廠) ；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司) ；搖瓶機(上海市離心機械研究所)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安試劑醫(yī)療器械廠)； 培養(yǎng)箱(上海市躍進醫(yī)療機械一廠)；離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)； pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)； 島津 LC-20AB 高效液相色譜儀，DAD 檢測。

1.1.2 試劑。葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、MgSO4·7H2O、KH2PO4、VB1、氨水、異丙醇、乙酸乙酯、甲醇、氯仿、三乙胺 、冰醋酸、二氯甲烷、苯酚、硫酸，以上試劑均為國產(chǎn)分析純；乙腈(Tedia，色譜純)。

1.1.3 菌種與試藥。菌種：靈芝(Ganodermalucidum)由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究中心保藏。草烏為毛茛科植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)的干燥母根，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定。標準品：烏頭堿Aconitine(批號110720-200410)、中烏頭堿Mesaconitine(批號0799-9403)、次烏頭堿Hypaconitine(批號0798-9403)購自中國藥品生物制品檢定所；苯甲酰烏頭原堿Benzoylaconine(批號B-010-110316)、苯甲酰中烏頭原堿Benzoylmesaconine(批號B-009-110316)、苯甲酰次烏頭原堿Benzoylhypaconine(批號B-010-110316)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖3%、黃豆粉0.8%、酵母膏0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%，VB1少量，pH自然(約6.0)。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4%、蛋白胨0.4%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%，VB1少量，pH自然(約6.0)。以上培養(yǎng)基滅菌條件均為121 ℃，滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 草烏總生物堿的提取。稱取適量草烏粉末(80目)，置潔凈干燥的具塞錐形瓶中，加氨試液，浸潤30 min，按1∶25比例加入藥粉量的異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合液，稱定重量，室溫超聲(30 kHz)30 min后，靜置24 h，取上清液，殘渣用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合液洗滌3次，合并上清液，回收溶劑，殘渣真空干燥并粉碎成100目細粉，即得草烏總生物堿提取物。

1.2.2 靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的液體種子按10%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基250 mL三角瓶，裝液量100 mL，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)7 d，發(fā)酵結(jié)束后，測定靈芝菌體生物量及胞內(nèi)外靈芝多糖含量。

1.2.3 起始pH對靈芝發(fā)酵的影響。用鹽酸或氫氧化鈉將初始pH分別調(diào)為3.5、4.5、5.5、6.0(自然)、6.5、7.5，培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)結(jié)束后，測定靈芝生物量和胞內(nèi)、胞外多糖的含量。

1.2.4 不同添加量的草烏粉和草烏總生物堿對靈芝發(fā)酵的影響。在液體發(fā)酵培養(yǎng)分別添加草烏粉和草烏總生物堿提取物，草烏粉添加量分別為5、10、15、20、25、30、35 g/L，草烏總生物堿提取物添加量分別為0.29、0.58、0.87、1.16、1.45、1.74、2.03 g/L(分別相當于草烏粉5、10、15、20、25、30、35 g/L)，調(diào)節(jié)pH為6，培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)結(jié)束后，測定靈芝生物量和胞內(nèi)外多糖的含量。

1.2.5 菌體生物量的測定。 將發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，沉淀用蒸餾水沖洗多次，收集菌絲體，并于 60 ℃烘干至恒重，稱重計算生物量：生物量(g/L)=菌體干重×1 000/發(fā)酵液體積。

1.2.6 多糖的測定。

1.2.6.1 胞外多糖的測定。取1 mL發(fā)酵上清液，加入4倍體積95%乙醇，充分混勻，4 ℃冰箱中靜置24 h，10 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀，取沉淀以乙醇清洗3 次，60 ℃除去乙醇，用4 mL蒸餾水溶解，用苯酚-硫酸法測多糖。

1.2.6.2 胞內(nèi)多糖的測定。取干燥的菌絲體，研細，加入10倍量蒸餾水于沸水浴中抽提3次，合并提取液，濃縮至原體積的1/5，加入4倍量95%乙醇，4 ℃冰箱靜置24 h后離心，棄上清，取沉淀以乙醇清洗3 次，60 ℃除去乙醇后，蒸餾水溶解，用苯酚-硫酸法測定胞內(nèi)多糖含量。

1.2.7 發(fā)酵液中生物堿的含量測定。

1.2.7.1 色譜條件。固定相：Akzo Nobel Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為緩沖液(0.2%冰醋酸用三乙胺調(diào)節(jié)pH至6.20)，B為乙腈；梯度洗脫，洗脫程序：0～44 min A-B(79:21)→(65:35)；44～65 min A-B(65:35)→(60:40)；65～85 min A-B(60∶40)→(20∶80)；進樣量10 μL；流速1.0 mL/min；檢測波長240 nm；柱溫30 ℃。

1.2.7.2 對照品溶液的配制。精密稱取Aconitine 1.12 mg、Mesaconitine 1.20 mg、Hypaconitine 4.12 mg、Benzoylaconine 1.42 mg、Benzoylmesaconine 3.10 mg、Benzoylhypaconine 3.91 mg，分別置5 mL量瓶中，加乙腈適量使溶解并稀釋至刻度。分別精密量取上述溶液0.3、0.8、0.2、0.2、0.1、0.1 mL于同一5 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，得對照品混合溶液的貯備液，放置4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.7.3 供試品溶液的配制。發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，精密量取10 mL，用氨水調(diào)pH至10，用氯仿萃取3次，分取氯仿層，回收氯仿，殘渣加乙腈使溶解并定容至2 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，濾液供HPLC測定用。

1.2.7.4 線性關(guān)系的考察。精密量取對照品混合溶液的儲備液，用乙腈分別按1/3、1/6、1/9、1/18進行倍量等度稀釋，搖勻，即得。連同貯備液按“1.2.7.1”方法分別注入高效液相色譜儀，分別以Aconitine、Mesaconitine、Hypaconitine、Benzoylaconine、Benzoylmesaconine、Benzoylhypaconine對照品溶液的質(zhì)量(μg)為橫坐標，色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線(表1)。

表1 草烏中6種酯型生物堿對照品線性關(guān)系考察結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基初始pH對菌體生物量及胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量的影響 由圖1可見，隨著pH升高，菌體生物量及胞內(nèi)外多糖先呈現(xiàn)快速增長，當pH為6時，生物量及胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量均達最大值，分別為7.50、0.25、0.42 g/L，當pH繼續(xù)提高至7.5時，菌體生物量及胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量均降低，較低和較高的pH均不利于菌體生物量及胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量的提高。

圖1 初始pH對菌體生物量、胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of initial pH on biomass，EPS and IPS polysaccharide yield

2.2 草烏粉添加量對靈芝發(fā)酵的影響 從圖2可看出，草烏粉可促進靈芝菌生長，添加量在 5～20 g/L，草烏粉對靈芝菌體生長促進作用呈線性關(guān)系，其中添加量為20 g/L時，效果最顯著，生物量達10.60 g/L，是對照的1.96倍。草烏粉可促進靈芝多糖的產(chǎn)生，添加量在5～15 g/L，草烏粉對靈芝胞外多糖產(chǎn)生呈線性關(guān)系，其中添加量為15 g/L時，對胞外多糖產(chǎn)生效果最顯著，產(chǎn)量達0.76 g/L,是對照的2.11倍，添加量為20 g/L時，對胞內(nèi)多糖產(chǎn)生效果最顯著，產(chǎn)量達0.54 g/L，是對照的2.57倍。

圖2 草烏粉添加量對菌體生物量、胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of dosage of Aconiti kusnezoffii powder on biomass，EPS and IPS polysaccharide yield

2.3 草烏總生物堿提取物添加量對靈芝發(fā)酵的影響 由圖3可知，添加量在 0.29～1.45 g/L時，草烏總生物堿對靈芝菌生長具有促進作用，其中添加量為0.87 g/L時，效果最顯著，生物量達11.30 g/L,是對照的2.13倍，添加量達1.74 g/L時，對靈芝菌體的生長呈現(xiàn)抑制作用。草烏總生物堿添加量在0.29～1.16 g/L，草烏對靈芝胞外多糖產(chǎn)生具有促進作用，其中添加量為0.87 g/L時，胞外多糖產(chǎn)量最大，達0.72 g/L,是對照的2.06倍，添加量為1.16 g/L時，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最高，達0.57 g/L,是對照的2.38倍。

圖3 草烏總生物堿提取物添加量對菌體生物量、胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of dosage of Aconiti kusnezoffii extracts on biomass，EPS and IPS polysaccharide yield

2.4 草烏粉及草烏提取物在靈芝發(fā)酵條件下生物堿質(zhì)量分數(shù)的變化 從表2可看出，與草烏粉+發(fā)酵培養(yǎng)基溶液對照相比，雙酯型生物堿Aconitine、Mesaconitine、Hypaconitine的相對含量均有所降低，分別下降94.5%、79.9%和86.8%，單酯型生物堿Benzoylaconine、Benzoylmesaconine、Benzoylhypaconine的相對含量均升高，分別增加2.8、5.4和5.5倍。與草烏總生物堿+發(fā)酵培養(yǎng)基溶液對照相比，雙酯型生物堿Aconitine、Mesaconitine、Hypaconitine的相對含量均有所降低，分別下降93.2%、89.1%和84.7%，單酯型生物堿Benzoylaconine、Benzoylmesaconine、Benzoylhypaconine的相對含量均升高，分別增加3.2、6.0和5.3倍。

表2 草烏粉和草烏提取物在靈芝液體發(fā)酵條件下生物堿質(zhì)量分數(shù)變化(n=3)

Table 2 The change of alkaloid mass fraction ofAconitikusnezoffiipowder and extracts inGanodermaLucidumsubmerged fermentation

%

注：↓表示質(zhì)量分數(shù)降低；↑表示質(zhì)量分數(shù)增加。

Note: ↓ indicates decrease of mass fraction; ↑ indicates increase of mass fraction.

在靈芝發(fā)酵液中添加草烏，靈芝可降低雙酯型生物堿的含量，空白對照和靈芝-草烏發(fā)酵液比較，雙酯型生物堿的信號強度高，單酯型生物堿的信號強度低，靈芝發(fā)酵液中不含烏頭堿類生物堿(圖4)。

3 討論

藥用真菌分泌的酶可分解纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，可對培養(yǎng)基質(zhì)進行分解利用；中藥中含有豐富的纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，利用中藥基質(zhì)進行藥用真菌的深層發(fā)酵生產(chǎn)，同時中藥中的成分(生物堿、皂苷、黃酮等)可促進或抑制藥用真菌的生長及代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，且藥用真菌中的酶系還可能對中藥中的成分進行轉(zhuǎn)化；在發(fā)酵制劑中，既包含中藥的成分,也包含靈芝的活性代謝產(chǎn)物，以及它們間相互作用產(chǎn)生的新成分，只要選擇的中藥與藥用真菌菌株搭配恰當，通過中藥中的成分與藥用真菌生長代謝間的相互作用，完全可能起到增效的作用。

藥用真菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生豐富的酶及各種活性物質(zhì)，不同的培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)條件，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量也不同。大量的酶可使底物產(chǎn)生各種化學(xué)反應(yīng)和各種代謝產(chǎn)物。草烏中主要成分是烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿等雙酶型生物堿，這些物質(zhì)既是毒性成分又是有效成分。該試驗研究靈芝液體發(fā)酵對草烏生物堿類成分的影響，以及草烏對靈芝生長及代謝產(chǎn)物的作用。結(jié)果表明，通過液體發(fā)酵，靈芝可以降低草烏次烏頭堿、中烏頭堿、烏頭堿等雙酯型生物堿含量，增加苯甲酰中烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿及苯甲酰烏頭堿含量，從而降低草烏的毒性。

注：a.混合對照品溶液；b.靈芝發(fā)酵液；c.空白對照；d.靈芝-草烏發(fā)酵液。1.苯甲酰中烏頭堿；2.苯甲酰次烏頭堿；3.苯甲酰烏頭堿；4.中烏頭堿；5.次烏頭堿；6.烏頭堿；n.未知成分。Note: a.Mixed control solution; b.Ganoderma lucidum fermentation broth; c.Blank control; d.Ganoderma lucidum-Aconiti kusnezoffii fermentation broth.1.Benzoyl mesaconitine; 2.Benzoyl hypaconitine; 3.Benzoylaconine; 4.Mesaconitine; 5.Hypaconitine; 6.Aconitine; n.Unknown component.圖4 混合對照品和供試品的HPLC圖Fig.4 HPLC of mixed control solution and tested substance

現(xiàn)有研究表明，選擇適當?shù)闹兴幖尤胨幱谜婢顚影l(fā)酵基質(zhì)，通過中藥中的成分與藥用真菌生長代謝間的相互作用可以起到增效的作用，但目前的研究多集中在中藥對藥用真菌生長及多糖等成分生產(chǎn)的影響方面[8-9]，而對于它們間的相互作用、中藥成分在發(fā)酵過程中的變化及增效的機理等方面研究甚少，應(yīng)是今后努力的方向。

在靈芝液體發(fā)酵中， 草烏的添加量在一定范圍內(nèi)，對靈芝生長及胞內(nèi)外多糖的產(chǎn)生均有促進作用，草烏總生物堿提取物添加量達0.45 g/L時，靈芝生物量及胞內(nèi)外多糖產(chǎn)生受到抑制，是否與生物堿的毒性有關(guān)，有待進一步研究。

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Study on Interaction betweenGanodermalucidumandAconitikusnezoffiiBased on Submerged Fermentation

WANG Shen-yan，CHEN Jian-wei，XUE Feng，WANG Juan-hong*

(School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu 210023)

[Objective] The aim was to study interaction betweenGanodermalucidumandAconitikusnezoffiiin liquid fermentation process.[Method] This paper explored the effect of initial pH，powder and total alkaloids extract ofAconitikusnezoffiion the yield of mycelium and the content of intracellular polysaccharides(IPS) and extracellular polysaccharides(EPS)，studied the effect ofGanodermalucidumfermentation on the content of aconitum alkaloids in the submerged fermentation ofGanodermalucidum.[Result]The yield of biomass and the content of IPS and EPS reached 7.50，0.25，0.42 g/L respectively when initial pH was 6.The yield of biomass and the content of IPS reached 10.60，0.54 g/L，and 1.96，2.57 times compared to the control respectively by the addition of 20 g/L ofAconitikusnezoffiiand the content of EPS was 0.76 g/L，2.11 times compared to the control by the addition of 15 g/L.The yield of biomass and the content of EPS reached 11.30，0.72 g/L，2.13，2.06 times compared to the control respectively by the addition of 0.87g/L of the extract ofAconitikusnezoffiiand the content of IPS was 0.57g/L，2.38 times compared to the control by the addition of 1.16 g/L of extract ofAconitikusnezoffii.[Conclusion] The content of the diester-aconitum alkaloids was decreased and the content of mono-ester aconitum alkaloids was increased inGanodermalucidumsubmerged fermentation.

Ganodermalucidum;Aconitikusnezoffii; Alkaloid; Polysaccharide; Biomass

江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程項目。

王身艷(1974- ),女，江蘇南京人，助理研究員，博士，從事食品與中藥生物技術(shù)研究。*通訊作者，講師，博士，從事腸道微生物研究。

2016-11-22

S 567

A

0517-6611(2016)36-0161-04