牦牛支氣管上皮細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

雷生妍，王光華，馬利青，邵方紅，張紅見，趙 靜

(1．青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016;2．青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 810016;3．青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，青海 西寧 810016)

牦牛支氣管上皮細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

雷生妍1，王光華2，馬利青2，邵方紅3，張紅見1，趙 靜1

(1．青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016;2．青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 810016;3．青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，青海 西寧 810016)

為了分離培養(yǎng)牦牛支氣管黏膜上皮細胞并傳代培養(yǎng)，利用支氣管結(jié)扎灌注酶冷消化法和支氣管組織貼壁法分離培養(yǎng)牦牛支氣管黏膜上皮細胞并傳代培養(yǎng)，第二代細胞制作細胞爬片通過H.E.染色，掃描電鏡和免疫熒光分別對培養(yǎng)的上皮細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行鑒定，結(jié)果兩種方法都獲得了牦牛支氣管黏膜上皮細胞，細胞活性好，純度高;H.E.染色可見細胞形態(tài)呈梭形、圓形、多角形等，細胞核深染，細胞質(zhì)淡紅色;掃描電子顯微鏡檢測中，明顯可見細胞的纖毛;免疫熒光鑒定細胞核清晰可見，細胞核呈亮綠色，表明分離培養(yǎng)的細胞為上皮細胞，可進一步為牦牛支氣管黏膜上皮細胞粘附模型的建立提供材料和奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

支氣管黏膜上皮細胞;分離;鑒定;培養(yǎng)

支氣管上皮細胞在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、肺囊性纖維化以及一些感染性呼吸道疾病的發(fā)病機制中均起著重要的作用［1］。細胞培養(yǎng)是研究病毒與研制疫苗的基礎(chǔ)技術(shù)，細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可為單個細胞或細胞群，但細胞培養(yǎng)工作十分繁瑣，環(huán)節(jié)較多。標準無菌室的設計、物品的準備、工作規(guī)則的制定及注意事項都是細胞培養(yǎng)順利完成的先決要素［2］。動物細胞培養(yǎng)是醫(yī)學，生物研究中廣泛采用的技術(shù)方法，即分為原代和傳代培養(yǎng)，有貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，細胞生長具有特殊的生物學性質(zhì)，需要無菌、恒溫和充分的營養(yǎng)環(huán)境。

國內(nèi)外已經(jīng)解決和改善了多種動物如牛、豬、犬、鼠、兔、雞等氣管 －支氣管上皮細胞的培養(yǎng)方法［3－6］，而本研究分離培養(yǎng)牦牛的支氣管黏膜上皮細胞。肖開顏等［7］分離培養(yǎng)了豬氣管上皮細胞，為進一步采用組織工程技術(shù)構(gòu)建帶有氣道上皮的“復合組織工程化氣管”奠定基礎(chǔ)。孫裴等［8］分離得到的支氣管上皮細胞可連續(xù)傳到第6代，傳代細胞活性好，純度高，可為進一步的支氣管上皮細胞永生化研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。韓石等［9］分離培養(yǎng)兔氣管黏膜上皮細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞，從而為進一步研究骨髓間充質(zhì)干細胞向氣管黏膜上皮細胞誘導分化及低免疫原性組織工程氣管假體上皮化的研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。本試驗通過分離培養(yǎng)牦牛支氣管黏膜上皮細胞，為建立牦牛支氣管黏膜上皮細胞粘附膜模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物和組織來源 健康牦牛支氣管，由青海裕泰食品有限公司提供。

1.2 主要試劑 0．25%胰蛋白酶－EDTA、L－甲狀腺素(T4)，胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補充劑(ITS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、L－谷氨酰胺，牛垂體提取物(BP)，胎牛血清等試劑，購自蘭州勵合生物有限公司;PCK/CK-18、SABC-FITC，購自武漢博士德生物制劑公司;H.E.染色試劑盒(Solarbio)。

1.3 主要儀器 400目鐵網(wǎng)濾篩、6孔細胞培養(yǎng)(Costar);臺式高速冷凍離心機(Neofuge－23R，上海力申科學儀器有限公司);超凈工作臺(HFsafe－1200，上海力申科學儀器有限公司);CO2培養(yǎng)箱(HERACELL 150，Thermo)倒置熒光顯微鏡(Aol，德國Olympus公司);細胞培養(yǎng)瓶。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)液配制 將DMEM培養(yǎng)基粉末倒入1 000 mL燒杯，無菌水沖洗包裝袋內(nèi)側(cè)，1．2 g NaHCO3再分別加入10μg/mL ITS(胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補充劑)、20 ng/mL L－甲狀腺素T4、100 IU/ mL青霉素、100μg/mL鏈霉素。10 IU/mL慶大霉素，5%～10%的胎牛血清。加無菌水定容到1 000 mL，分裝放－4℃冰箱備用。

1.4.2 細胞培養(yǎng)

1.4.2.1 貼壁培養(yǎng) 在超凈工作臺中取出支氣管，小心剝離氣管的筋膜和脂肪組織，剪取一塊支氣管放入平皿內(nèi)，超純水漂洗3次、高壓水漂洗1～2次、PBS漂洗3次，加2 mL PBS剪碎(大約2 000～5 000下，15 min左右)，盡可能剪碎的組織再用PBS漂洗3次，再用含有5%～10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液洗3次。吸取組織塊連DMEM培養(yǎng)液一起倒入細胞培養(yǎng)瓶，畫“之”字形分兩瓶，放置5～10 min，在超凈工作臺中倒置培養(yǎng)瓶擰緊瓶蓋放置2～4 h。然后分別加入5 mL DMEM完全培養(yǎng)液，平拿轉(zhuǎn)移到CO2培養(yǎng)箱。

貼壁培養(yǎng)還可以用另一種方法:之前步驟和上述一樣，在轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶之前，加入2 mL胰蛋白酶消化5 min后加2 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。1 000 r/min(8℃)離心5 min，棄上清，加5 mL培養(yǎng)液吹打混勻“之”字形分裝到兩個細胞培養(yǎng)瓶中，平拿轉(zhuǎn)移到CO2培養(yǎng)箱。

1.4.2.2 支氣管結(jié)扎灌注酶冷消化法 此方法參考王津津［10］的方法，具體操作步驟如下:取出用0.85%生理鹽水浸泡的支氣管，超純水漂洗3次、高壓水漂洗1～2次、PBS漂洗3次，結(jié)扎支氣管一端，注入0．25%胰蛋白酶，然后結(jié)扎支氣管的另一端，用PBS浸泡結(jié)扎好的支氣管放－4℃冰箱24 h后，在超凈工作臺中，取出消化的支氣管，吸取消化液400目網(wǎng)篩過濾，收集濾液加入完全培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min(4℃)離心10 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)液再離心，重復兩次，洗去胰蛋白酶。離心好后棄上清再加完全培養(yǎng)液分裝到兩個細胞培養(yǎng)瓶中，放置10 min，平拿轉(zhuǎn)移到CO2培養(yǎng)箱。

1.4.3 上皮細胞鑒定

1.4.3.1 H.E.染色 參考韓石［9］的方法，具體操作步驟如下:

細胞爬片的制備:將蓋玻片置于濃硫酸中浸泡過夜，第2天先用自來水沖洗干凈，再置于無水乙醇中浸泡6 h，再用蒸餾水沖洗干凈，放在飯盒烘干后，進行高壓消毒，高壓后放入烤箱中烤干;用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的細胞，5 min內(nèi)等細胞從瓶壁脫落，加入(含10%胎牛血清)完全培養(yǎng)液終止消化，然后1 500 r/min(4℃)離心5 min后棄上清，再加5 mL完全培養(yǎng)液重復離心，收集細胞沉淀，再加入適量完全培養(yǎng)液，吹打混勻，使細胞完全懸浮;先在6孔培養(yǎng)板每孔滴少量完全培養(yǎng)液，再將高壓烘干后的玻片放入6孔培養(yǎng)板中，然后將細胞懸液直接滴在玻片上，放37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

樣品固定:取出細胞爬片，用PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定30 min;蘇木素染色2～3 min，蒸餾水沖洗;95%乙醇30 s;伊紅染液染色1 min，蒸餾水洗滌，室溫自然晾干細胞爬片后，中性樹膠封片，高倍顯微鏡觀察。

1.4.3.2 掃描電鏡 參考韓石［9］的方法，具體操作步驟如下:對上述方法培養(yǎng)的第2代氣管黏膜上皮細胞常規(guī)爬片，2．5%中性戊二醛磷酸緩沖液固定，在4℃條件下保存;室溫條件下用0．1MPBS緩沖液清洗樣品15 min，重復3次;依次在50%，70%，80%，90%，95%，100%梯度酒精脫水，每一濃度15 min;室溫條件下，先浸入乙酸異戊酯和丙酮混合溶液(體積比1∶1)30 min，再浸入純乙酸異戊酯置換約30 min;臨界點干燥儀對樣品干燥3 h;采用SCD500型離子濺射鍍膜儀對樣品進行導電處理;粘貼到樣品板上進行掃描電鏡觀察。

2.2 兩組hs-CRP與血嗜酸粒細胞水平比較 治療后，兩組患者hs-CRP與血嗜酸粒細胞水平較治療前明顯降低，且B組均低于A組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

1.4.3.3 免疫熒光鑒定 對上述方法培養(yǎng)的第二代氣管黏膜上皮細胞常規(guī)爬片，4%多聚甲酸固定60～90 min;0．5%Triton X-l00 37℃穿孔20 min，PBS漂洗5 min 2次;滴加1%BSA，37℃封閉30 min，甩去多余液體，不洗:滴加1%BSA 1∶32稀釋的一抗(PCK/CK-18)，37℃2 h，PBS漂洗5 min 2次;滴加1%BSA 1∶64稀釋的二抗(生物素化山羊抗小鼠IgG)，37℃1 h，PBS漂洗5 min 2次;滴加1% BSA 1∶64稀釋的SABC-FITC，37℃0．5 h，PBS漂洗5 min 2次;留少量PBS，觀片?？瞻讓φ战M采用PBS代替一抗。

1.4.4 細胞傳代

1.4.4.1 原代細胞鋪滿細胞培養(yǎng)瓶80%時，把細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液吸凈，用無菌的PBS沖洗培養(yǎng)瓶，洗去殘留的培養(yǎng)液。

1.4.4.2 用0．25%胰酶消化細胞，顯微鏡下觀察細胞由梭形成圓形。加入完全培養(yǎng)液終止消化，反復吹打使細胞盡量從瓶底分離，1 500 r/min(4℃)離心5 min，棄上清液，加入少量培養(yǎng)液，反復吹打，使上皮細胞重懸。

1.4.4.3 再加少量培養(yǎng)液反復吹打使細胞再次懸浮，1 500 r/min(4℃)離心5 min，棄上清液(此過程反復2次，為洗去殘留的胰蛋白酶)。

1.4.4.4 吹打混勻后重懸液轉(zhuǎn)至1次性培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。按1∶2比例傳代。

1.4.5 細胞凍存 凍存液配制:70%完全培養(yǎng)液加20%胎牛血清加10%DMSO(DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖)凍存液常用DMSO(二甲基亞砜)作為凍存保護劑［11－14］。

取對數(shù)生長期的細胞，用0．25%胰蛋白酶消化，消化液1 000 r/min(4℃)離心5 min，棄上清加入配制好的凍存液，吹打混勻分裝到凍存管中，每管1～1．5 mL(調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106/mL～1×107/mL)。在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。

1.4.6 細胞復蘇 從液氮罐中取出冷凍管。迅速放入37℃水浴中，并不時搖動，在1 min內(nèi)使其完全融化。1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入適量培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代牦牛支氣管黏膜上皮細胞培養(yǎng)分析 采用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，培養(yǎng)12～24 h后大量上皮細胞貼壁，呈圓形或梭形，部分上皮細胞漂浮于培養(yǎng)液中，每2 d換1次液，約6～8 d上皮細胞長滿瓶底，形態(tài)呈扁平不規(guī)則狀，周圍輪廓清晰，呈鋪路石樣(100×)(見中插彩版圖1－A、B)。

2.2 傳代牦牛支氣管黏膜上皮細胞培養(yǎng)分析 傳代后的細胞比原代細胞生長速度快，貼壁時間短(100×)(見中插彩版圖1－C)。

2.3 支氣管上皮細胞的鑒定

2.3.1 H.E.染色 上皮細胞的鑒定采用H.E.染色的方法，即堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅分別于細胞核和細胞質(zhì)發(fā)生作用，使細胞的微細結(jié)構(gòu)通過顏色而改變它的折光率，從而在光鏡下能清晰地呈現(xiàn)出細胞圖像。貼壁培養(yǎng)第二代細胞經(jīng)H.E.染色的效果圖，可見細胞形態(tài)呈梭形、圓形、多角形等，細胞核深染，細胞質(zhì)淡紅色(200×)(見中插彩版圖1－D)。

2.3.2 掃描電鏡和免疫熒光 部分細胞可見纖毛。(見中插彩版圖1－E)，免疫突光(FITC－PCK/CK－18)顯示細胞密集排列，細胞核清晰可見，細胞質(zhì)呈亮綠色 集排列，細胞核清晰可見，細胞質(zhì)呈亮綠色(200×)(見中插彩版圖1－F)。

3 討論

3.1 本試驗使用兩種方法分離了牦牛支氣管黏膜上皮細胞，分別為支氣管結(jié)扎灌注酶冷消化法和支氣管組織貼壁法。王津津等［10］人研究了支氣管結(jié)扎灌注酶冷消化的方法分離細胞，為了提高細胞的活力和數(shù)量，消化的時間是至關(guān)重要的，消化時間長的話，細胞越容易分離，但消化過長，細胞活力下降，是因為細胞和酶液作用時間太長，所以一般消化時間為15～18 h，即可終止消化。收集的細胞懸液中的組織塊可能會影響細胞的貼壁，可采取400目網(wǎng)篩過濾的方法，去除組織塊。組織貼壁培養(yǎng)的方法，操作簡單，費用較低，即可以減少細胞的流失，又可以減少被真菌污染;并且在細胞的剪切過程中，會出現(xiàn)游離的單個細胞，這些可以生長增殖［15］，可牦牛支氣管組織比較硬，剪切時難剪碎，從而剪碎組織的大小直接決定組織塊的貼壁，因此細胞生長較慢，相比之下，支氣管結(jié)扎灌注冷酶消化的方法更適合牦牛支氣管黏膜上皮細胞的培養(yǎng)。

3.2 本試驗用H.E.染色的方法來鑒定牦牛支氣管黏膜上皮細胞，該染色過程從化學反應看，組織細胞內(nèi)含有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)，細胞的酸性物質(zhì)與堿性染料的陽離子結(jié)合，而細胞核的堿性物質(zhì)與酸性染料的陰離子結(jié)合，使其中酸性細胞核被堿性的蘇木素染成藍色，而堿性的胞漿被酸性染料伊紅染成紅色。其結(jié)果細胞核呈藍色，胞漿呈紅色。從物理學現(xiàn)象看，主要有吸附，吸收之說，H.E.染色提供良好的核漿對比染色，是細胞化學染色最常用的一種方法。

3.3 有報道［16］稱可以用較便宜的胰蛋白酶可以替代鏈酶蛋白酶，來進行細胞的消化。動物細胞表面很多和細胞培養(yǎng)瓶結(jié)合的蛋白質(zhì)都是帶有鈣或鎂離子的蛋白質(zhì)，EDTA對鈣鎂離子有很好的螯合作用，可以更好的輔助胰蛋白酶降解相應蛋白質(zhì)，在消化效率上，會有很大的提高，所以本研究選用0．25%胰蛋白酶—EDTA。至今無血清培養(yǎng)技術(shù)變得日益成熟［17－19］，但本研究用(含5% ～10%胎牛血清)DMEM培養(yǎng)液來進行牦牛支氣管上皮細胞的分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)加入的血清濃度和時間對上皮細胞的培養(yǎng)有很大的影響，還有胰島素－轉(zhuǎn)鐵因子-硒補充劑在上皮細胞的培養(yǎng)中不可或缺。至于通過400目網(wǎng)篩過濾細胞消化液，是為了保證支氣管上皮細胞的純度和活性，可以過濾多余的組織和成纖維細胞，用胰蛋白酶消化的細胞消化液離心時，用培養(yǎng)液反復沖洗兩次，目的是為了洗去殘留的胰蛋白酶，保證細胞更好的生長。

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Isolation，culture and identification of yakbronchial epithelial cells

LEI Sheng-yan1，WANG Guang-hua2，MA Li-qing2，SHAO Fang-hong3，ZHANG Hong-jian1，ZHAO Jing1

(1．Qinghai University of Agriculture and Animal Husbandry，Xining 810016，China;2．Qing hai Livestock Farming Vet Academy of Sciences，Xining 810016，China;3．Ecological environment of Engineering college，Qinghai University，Xining 810016，China)

In order to isolate and culture the bronchial epithelialcells of yak，the bronchial mucosal epithelial cells wereisolated and cultured by the method of bronchial ligation and cold digestion and bronchial tissue adherence．The second generation cells were observed by H．E．staining，and the morphology and structure of cultured epithelial cells were identified by scanning electron microscopy and immunofluorescence，results show that the two methods were used to obtain the yak bronchial epithelial cells，which with high activity and high purity;H．E．staining showed that the cultured cells were spindle shaped，round，polygonal，hyperchromatic nuclei，and cytoplasm pale red．Scanning electron microscopy showed that the cells were clearly visible．Fluorescent identification showed that the nucleus was clearly visible and the nucleus was bright green．The results showed that the cultured cells were epithelial cells．

bronchial epithelial cells;isolation;identification;culture

ZHAO Jing

S823.85

A

0529-6005(2017)06-0039-04

2016-11-15．

國家自然科學基金項目(31560701);教育部國際合作與交流司項目(2016-12);青海省科技廳項目(2016－HZ－823)

雷生妍(1992-)，女，碩士生，研究方向為高原動物畜禽生理學，E-mail:1657628000@qq．com

趙靜，E-mail:1974679163@qq．com