乳酸菌噬菌體及其PCR法檢測(cè)研究進(jìn)展

朱良工，關(guān)松梅，劉海燕，王丹，張?bào)?/p>

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150028；2.黑龍江東方學(xué)院，哈爾濱150086；3.新希望乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，成都610016）

乳酸菌噬菌體及其PCR法檢測(cè)研究進(jìn)展

朱良工1，關(guān)松梅2,3，劉海燕3，王丹1，張?bào)?

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150028；2.黑龍江東方學(xué)院，哈爾濱150086；3.新希望乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，成都610016）

簡(jiǎn)述了乳酸菌噬菌體以及一些利用PCR技術(shù)檢測(cè)噬菌體的方法，旨在為相關(guān)研究人員提供參考，同時(shí)以期為乳制品行業(yè)開展監(jiān)測(cè)噬菌體污染奠定基礎(chǔ)。

乳酸菌；噬菌體；PCR；檢測(cè)

0 引言

噬菌體無(wú)處不在，是當(dāng)前地球上最主要的生物實(shí)體?？茖W(xué)家曾試圖利用噬菌體治療疾病，如痢疾或葡萄球菌感染等。噬菌體的關(guān)鍵角色之一是平衡每個(gè)共享環(huán)境的細(xì)菌數(shù)量。但是在乳制品發(fā)酵行業(yè)中，尤其在干酪生產(chǎn)的過程中，噬菌體是發(fā)酵異常的主要原因。

噬菌體污染問題廣泛存在于食品、化工、制藥、飼料、農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)，然而乳制品行業(yè)可能是感染噬菌體頻率最高的行業(yè)。在發(fā)酵乳與奶酪的生產(chǎn)中，都有噬菌體污染的可能性。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在奶酪生產(chǎn)中，60%～70%的生產(chǎn)中斷是由于噬菌體污染[1]。

在發(fā)酵工業(yè)中，原料奶一般為巴士殺菌，這提供了噬菌體生存的條件。車間中的設(shè)備、空氣、地板等都可能存在噬菌體，這是引發(fā)噬菌體經(jīng)常性污染的原因[2]。乳酸菌在感染噬菌體后會(huì)延緩發(fā)酵甚至停止發(fā)酵，給企業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本文介紹了乳酸菌噬菌體，同時(shí)總結(jié)了目前的一些乳酸菌噬菌體的檢測(cè)方法。

1 乳酸菌及噬菌體簡(jiǎn)介

1.1 乳酸菌

乳酸菌是真細(xì)菌綱真細(xì)菌目中的乳酸細(xì)菌科，能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸，是一類無(wú)芽孢、不運(yùn)動(dòng)或很少運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陽(yáng)性菌總稱，按其細(xì)胞形狀可分為兩類，一類為呈球狀的鏈球菌族，一類為呈桿狀的乳酸桿菌族[3]。鏈球菌族分為五個(gè)屬，分別為雙球菌屬(Diplococ-cus)；鏈球菌屬(Streptococcus)；足球菌屬(Pe?dio-coccus)；明串珠菌屬(Leucomostoc)；消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)，對(duì)發(fā)酵行業(yè)最為重要的是鏈球菌屬。乳酸桿菌族分為五個(gè)屬：乳酸桿菌屬(Lactobacil?lus)；真細(xì)菌屬(Eubacterium)；鏈條桿菌屬(Catenabacteri?um)；假枝桿菌屬(Ramibacterium)；運(yùn)動(dòng)桿菌屬(Cillobacte?rium)[3]。其中，乳酸桿菌屬在發(fā)酵行業(yè)中應(yīng)用最為廣泛。乳酸菌發(fā)酵根據(jù)其發(fā)酵產(chǎn)物可分為兩種類型，一種為同型乳酸發(fā)酵，代謝產(chǎn)物只有乳酸，另一種為異型乳酸發(fā)酵，代謝產(chǎn)物除乳酸外還可產(chǎn)生甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、醋酸、乙醇、二氧化碳和甘露醇等[4]，賦予發(fā)酵產(chǎn)品甜、香、維生素、胞外多糖和細(xì)菌素等使其具有健康和安全的特性[5]。近年來(lái)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌經(jīng)常用于乳酸菌發(fā)酵劑的使用。

1.2 噬菌體

噬菌體能侵染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物細(xì)胞，是一類主要由核酸和蛋白質(zhì)組成的病毒，噬菌體的遺傳物質(zhì)是核酸，為DNA或RNA[6]，多為DNA，衣殼和尾部由蛋白質(zhì)構(gòu)成。噬菌體有兩種類型，一種為烈性噬菌體，另一種為溫和噬菌體，烈性噬菌體可導(dǎo)致宿主菌裂解。

在1896年英國(guó)科學(xué)家Ernest Hankin初次提出了微生物中存在某種抗菌活性物質(zhì)的現(xiàn)象。1898年，Niko?lay Gamaleya在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象[7]。

英國(guó)科學(xué)家Frederick wort在1915年培養(yǎng)金黃色葡萄球菌的過程中，第一次發(fā)現(xiàn)菌落上出現(xiàn)透明斑，并將該現(xiàn)象解釋為病毒感染[8]。1917年，巴黎巴斯德研究所的法裔加拿大微生物學(xué)家Felix d’Herelle將這些抗菌活性物質(zhì)解釋為由寄生在細(xì)菌中的病毒所引起,并正式命名為“噬菌體”[9]。1944年Baylor等[10]利用電子顯微鏡觀察噬菌體，為噬菌體的研究奠定了基礎(chǔ)。

1.3 乳酸菌噬菌體

20世紀(jì)30年代首次報(bào)道了感染噬菌體會(huì)影響牛乳發(fā)酵，這給乳品發(fā)酵行業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。乳酸菌在被噬菌體侵染后，其菌株的產(chǎn)酸能力和蛋白水解能力減弱而導(dǎo)致產(chǎn)酸下降，延緩發(fā)酵甚至終止發(fā)酵，使乳制品質(zhì)量（例如，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、味道、質(zhì)地等等）下降[11-12]。乳酸菌類型復(fù)雜，致使乳酸菌噬菌體種類繁多。

1.3.1 乳酸菌噬菌體分類

在噬菌體研究初期根據(jù)其宿主范圍、形態(tài)進(jìn)行和侵染途徑進(jìn)行分類，據(jù)其侵染途徑可分為烈性噬菌體和溫和噬菌體，烈性噬菌體可在短時(shí)間內(nèi)可完成一系列侵染過程實(shí)現(xiàn)噬菌體對(duì)乳酸菌的裂解增殖，而溫和噬菌體在侵入宿主菌后，只將噬菌體DNA整合到宿主菌染色體上，一般不對(duì)宿主菌產(chǎn)生裂解作用[5]。乳酸菌噬菌體根據(jù)其形態(tài)可以分為有尾噬菌體和無(wú)尾噬菌體，其中大部分都被歸為有尾病毒目，有尾噬菌體又可以分為長(zhǎng)尾噬菌體、肌尾噬菌體、短尾噬菌，乳酸菌噬菌體中頭等長(zhǎng)，具有長(zhǎng)而非收縮性的尾是最常見的形態(tài)[13]。隨著對(duì)噬菌體研究的深入，可根據(jù)噬菌體的基因相關(guān)性和同源性把噬菌體分成12類，在發(fā)酵乳制品中分離出的噬菌體大多為長(zhǎng)尾噬菌體科的圓頭狀936型、長(zhǎng)頭狀c2型和圓頭狀p335型[14-15]。其中936型和c2型具有較強(qiáng)的裂解性和較為廣泛的宿主范圍。

1.3.2 乳酸菌噬菌體侵染機(jī)制

乳酸菌噬菌體作用于乳酸菌的過程較快。如當(dāng)一個(gè)乳酸菌噬菌體感染了一個(gè)乳酸菌，經(jīng)20～40 min后，就能感染15～100個(gè)。噬菌體侵染細(xì)菌時(shí)，通常分為潛伏期和裂殖期，前期表現(xiàn)緩慢。當(dāng)噬菌體數(shù)量少時(shí)，對(duì)發(fā)酵劑無(wú)影響，但到達(dá)裂殖后，乳酸菌發(fā)酵劑中的細(xì)菌在短時(shí)間內(nèi)就會(huì)被破壞[16]。

乳酸菌被噬菌體侵染的過程可分為四個(gè)階段，首先噬菌體與乳酸菌表面發(fā)生非特異性吸附，該過程有可逆性，受外界條件的影響，如pH值和溫度；然后噬菌體尾部與細(xì)菌表面受體發(fā)生特異性共價(jià)結(jié)合，這一過程不可逆，決定噬菌體宿主的特異性[17]。吸附結(jié)束后，經(jīng)過擠壓將DNA注入宿主細(xì)胞，其外殼多留在細(xì)菌表面。在噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，DNA通過控制宿主細(xì)胞基因的復(fù)制而轉(zhuǎn)錄噬菌體基因，并翻譯噬菌體蛋白，使子代噬菌體裝配完整。在宿主細(xì)胞完成大量子代噬菌體裝配后，噬菌體產(chǎn)生的溶菌素酶溶解細(xì)胞，從而釋放噬菌體。

1.3.3 乳酸菌噬菌體基因組概況

由于噬菌體基因組小，較易測(cè)序，在基因組測(cè)序中表明，大多數(shù)噬菌體含有前噬菌體，噬菌體基因組學(xué)對(duì)研究抗噬菌體菌株以及噬菌體檢測(cè)都具有重要意義，基因組序列信息逐年呈上升趨勢(shì)。乳球菌噬菌體全基因組序列占已知乳酸菌噬菌體序列較大部分，目前已公布于GenBank中的乳酸菌噬菌體基因組共131個(gè)，其中34個(gè)乳桿菌噬菌體基因組，87個(gè)乳球菌噬菌體基因組，10個(gè)前噬菌體[1]。乳酸菌噬菌體均為有尾雙鏈DNA噬菌體，基因組大小在18～55 kb之間，鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比例從37%～48%，與宿主基因組相當(dāng)。嗜熱鏈球菌噬菌體都是長(zhǎng)尾噬菌體，且所有已知的嗜熱鏈球菌具有DNA同源性，而乳桿菌噬菌體全基因序列研究較少，已知噬菌體基因組均為雙鏈線性DNA分子。

2 PCR方法檢測(cè)乳酸菌噬菌體

西班牙、阿根廷、白俄羅斯等國(guó)家都對(duì)重要的乳制品菌株的噬菌體進(jìn)行了研究[10,18-19]。在這些研究中，主要研究了乳球菌、乳桿菌噬菌體的應(yīng)用過程。目前檢測(cè)乳酸菌噬菌體的方法多使用雙層瓊脂平板法和通量血細(xì)胞計(jì)數(shù)[13,20-21]。雙層瓊脂平板法原理是使單個(gè)噬菌體侵入處于生長(zhǎng)繁殖階段宿主細(xì)胞,經(jīng)過若干代生長(zhǎng)繁殖后才能形成肉眼能判斷的溶菌斑，同溶菌斑周圍的宿主細(xì)胞也要經(jīng)若干代生長(zhǎng)繁殖才能顯出較高密度把溶菌斑襯托出來(lái)，這個(gè)過程需要8～12 h以上。此種方法操作簡(jiǎn)單，但是需要使用相應(yīng)的敏感菌株，在噬菌體感染初期無(wú)法顯示噬菌斑，并且所需時(shí)間較長(zhǎng)。通量血細(xì)胞計(jì)數(shù)法操作簡(jiǎn)單，但是結(jié)果不夠準(zhǔn)確，且耗時(shí)較長(zhǎng)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在生物體外用于特殊DNA復(fù)制的分子生物學(xué)技術(shù)，可以放大并擴(kuò)增特定DNA片段。PCR方法主要是能夠使微量DNA大幅擴(kuò)增。美國(guó)Mullis在1983年最初提出假想，在1985年完成了聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明，這標(biāo)志著PCR技術(shù)的誕生。如今，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。臺(tái)籍科學(xué)家錢嘉韻在1973年發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，將PCR技術(shù)的基礎(chǔ)性研究帶到了一個(gè)新的高度。DNA提取的質(zhì)量和濃度是PCR檢測(cè)的關(guān)鍵，提取方法是實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ囊粋€(gè)關(guān)鍵性因素[22]。目前，PCR方法已成功應(yīng)用于噬菌體的檢測(cè)。

2.1 普通PCR

2006年，廖威等使用PCR方法檢測(cè)蘇云金桿菌的溶原性噬菌體根據(jù)蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis, B.t)溶原性噬菌體GIL01(GenBank Accession Number: AJ536703)的同源序列設(shè)計(jì)出一對(duì)引物，將35株生產(chǎn)菌株MZ1(血清型H3a3b)和B.t標(biāo)準(zhǔn)菌株活化后作模板，其中16株菌株包括MZ1擴(kuò)增出約750 bp的預(yù)期產(chǎn)物[23]，通過噬菌斑實(shí)驗(yàn)，證明這16株菌株中的生產(chǎn)菌株MZ1為溶原菌噬菌體。從而證明PCR方法鑒定蘇云金桿菌溶原性的可行性。

通過對(duì)指示菌法、直接電鏡法和DNA鑒定法的比較，證明PCR方法檢測(cè)噬菌體靈敏度更高，且快速簡(jiǎn)潔。目前，利用PCR方法已經(jīng)成功檢出牛奶或乳清中的乳球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬噬菌體，最低檢出限為103PFU/mL，普通PCR方法檢出限為104～107PFU/mL[24-29]。

目前選育的乳酸菌益生菌菌株種類繁多，益生菌逐漸受到大眾的喜愛和認(rèn)可，但是這種益生菌菌株較普通菌株感染噬菌體的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，這嚴(yán)重影響了益生菌酸奶的生產(chǎn)[30]。尤其是烈性噬菌體的存在，可以快速裂解益生菌菌株，所以，PCR方法以其快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)而成功應(yīng)用于益生菌菌株噬菌體的檢測(cè)。AnaG.Binetti等利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即PCR方法檢測(cè)干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌噬菌體[31]。在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中只有φA2和φAT3的全基因序列，所以選取特異性基因片段設(shè)計(jì)引物。該方法的最低檢測(cè)限位104PFU/mL，可以檢測(cè)原料乳、發(fā)酵乳以及奶酪乳清中干酪和副干酪菌株噬菌體的存在。這種方法可以用于工業(yè)生產(chǎn)中的批量檢測(cè)，在污染初期即可以檢測(cè)到噬菌體的存在，對(duì)益生菌發(fā)酵行業(yè)有意義。

2.2 RT-PCR

病毒的核酸多為RNA，噬菌體是病毒的一種，利用PCR技術(shù)檢測(cè)遺傳物質(zhì)為RNA的病原體，需要將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增，即RT-PCR[32]。代小英等比較了實(shí)時(shí)熒光RT-PCR和普通RT-PCR檢測(cè)噬菌體MS2的差異[33]，將噬菌體MS2復(fù)制酶基因和衣殼蛋白基因利用實(shí)時(shí)熒光一步RT-PCR法和普通的兩步RT-PCR法分別進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)兩種方法的檢測(cè)靈敏度和特異性進(jìn)行比較。結(jié)果表明，普通的兩步RT-PCR法特異性強(qiáng)于熒光一步RT-PCR法，但后者的靈敏度比前者高104倍。RT-PCR應(yīng)用于RNA類型的病毒檢測(cè)，該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)。由于大部分乳酸菌噬菌體遺傳物質(zhì)為DNA，所以PT-PCR應(yīng)用到乳酸菌噬菌體的檢測(cè)尚未見報(bào)道。

2.3 熒光定量PCR

Daniel C.Edelman利用熒光定量PCR檢測(cè)和量化在溶菌產(chǎn)物DNA純化之前的噬菌體[34-36]。首先在噬菌體下面發(fā)現(xiàn)了一個(gè)點(diǎn)狀單元，檢測(cè)純化DNA樣本，至少有89種病毒。使用熒光定量PCR對(duì)未知濃度的噬菌體制劑進(jìn)行評(píng)估，靈敏度和精密度大大提高。Mai Huong在2011年利用熒光定量PCR的方法定量檢測(cè)乳清中的噬菌體c2,936和P335[37]。采集法國(guó)三個(gè)農(nóng)場(chǎng)的山羊奶樣本，在普通PCR的基礎(chǔ)上將各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)時(shí)定量PCR的一個(gè)難點(diǎn)是原料乳中DNA提取的優(yōu)化，需提取出最大量病毒基因組和消除壓抑PCR反應(yīng)，引物PCR條件的選擇也很重要。使用非特異性綠色熒光染料SYBR直接檢測(cè)和量化三組噬菌體。設(shè)計(jì)特異性引物，然后建立熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量測(cè)定樣品中的噬菌體濃度，得出的Ct值對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線[38]。該方法可以對(duì)乳酸菌噬菌體進(jìn)行定量檢測(cè)，從而可以更有效的殺滅噬菌體，但是該方法成本較高，需要專業(yè)的操作人員，不能區(qū)分噬菌體是否滅活，難以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的檢測(cè)，可將傳統(tǒng)方法與該方法結(jié)合，從而降低成本，并達(dá)到定量檢測(cè)的要求。

2.4 多重PCR

多重PCR的原理是同時(shí)將多對(duì)特異性引物加入反應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)增出多條大小存在明顯差異的目的DNA片段，根據(jù)產(chǎn)物的片段大小或利用分子雜交實(shí)現(xiàn)多病原的同時(shí)檢測(cè)[39]。

S Labrie在2000年利用多重PCR檢測(cè)乳酸菌噬菌體936、c2和P33，在一個(gè)反應(yīng)中選取三段特異性片段，分別設(shè)計(jì)引物[40]。BD Rio在2007年利用多重PCR監(jiān)測(cè)發(fā)酵乳生產(chǎn)過程，檢測(cè)德式乳桿菌噬菌體3種、乳鏈球菌噬菌體和乳酸菌噬菌體，用噬菌體基因組序列和守恒的區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)五對(duì)引物[41]，分別對(duì)應(yīng)上面的噬菌體，引物設(shè)計(jì)生成特定片段的大小取決于基因的特異性。該方法可以檢測(cè)到在未經(jīng)發(fā)酵牛奶中的噬菌體，根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物可以檢測(cè)多個(gè)噬菌體，是PCR方法應(yīng)用于噬菌體檢測(cè)的一大進(jìn)步。

3 結(jié)論

迄今為止，在乳制品行業(yè)中，噬菌體感染乳酸菌仍然是一個(gè)嚴(yán)重的問題，相關(guān)人員一直在竭盡所能的進(jìn)行防治、檢測(cè)和治理噬菌體污染問題，已經(jīng)取得一定的成果，但是仍然有噬菌體污染情況偶有發(fā)生，尤其是我國(guó)無(wú)論是生產(chǎn)環(huán)境還是檢測(cè)方法都較國(guó)外存在一定差距。目前，我國(guó)檢測(cè)噬菌體的方法大多停留在傳統(tǒng)噬菌斑法，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，而分子生物學(xué)方法檢測(cè)時(shí)間短，效率高，是噬菌體檢測(cè)行業(yè)的福音，但是該方法成本相對(duì)較高，并不適用于工廠中的批量檢測(cè)，如何降低檢測(cè)成本，使之適合于實(shí)際生產(chǎn)中的檢測(cè)，是接下來(lái)的研究重點(diǎn)。

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Research progress on Lactic acid bacteria phage and its PCR detection

ZHU Lianggong1,GUAN Songmei2,3,LIU Haiyan3,WANG Dan1,ZHANG Yun2
（1.Green Food Science Research Institute of Heilongjiang,Harbin 150028,China;2.East College of Heilongjiang Har?bin 150086,China;3.Technology Center,New Hope Dairy Co.,Ltd.,Chengdu 610016)

This paper describes some methods of detecting phage using PCR technology,which aims to provide reference for relevant re?searchers and lay the foundation for monitoring phage pollution in dairy industry.

Lactic acid bacteria;phage;molecular biology;detection

TS252.7

：B

：1001-2230（2017）06-0035-04

2016-12-24

朱良工(1961-),男,研究員級(jí)高級(jí)工程師,從事乳品加工方面的研究。

張?bào)?/p>