微環(huán)境對周圍神經(jīng)損傷端-側(cè)移位縫合術(shù)后神經(jīng)再生的影響*

梅遠東, 祝 偉, 顧 晨**, 顧玉東

(1.常熟市第二人民醫(yī)院 手足外科, 江蘇 常熟 215500； 2.復旦大學附屬華山醫(yī)院 手外科, 上海 200040)

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微環(huán)境對周圍神經(jīng)損傷端-側(cè)移位縫合術(shù)后神經(jīng)再生的影響*

梅遠東1, 祝 偉1, 顧 晨1**, 顧玉東2

(1.常熟市第二人民醫(yī)院 手足外科, 江蘇 常熟 215500； 2.復旦大學附屬華山醫(yī)院 手外科, 上海 200040)

目的： 探討微環(huán)境對周圍神經(jīng)損傷端-側(cè)移位縫合術(shù)后神經(jīng)功能的影響。方法： 選取SD大鼠120只，隨機分為假手術(shù)組(組A)、右側(cè)肌皮神經(jīng)離斷后端-側(cè)縫合至尺神經(jīng)組(組B)、右側(cè)離斷神經(jīng)端-側(cè)縫合后局部植入神經(jīng)營養(yǎng)因子組(組C)、右側(cè)離斷神經(jīng)端-側(cè)縫合后局部植入激活態(tài)雪旺細胞組(組D)以及右側(cè)離斷神經(jīng)端-側(cè)縫合后局部植入神經(jīng)干細胞組(組E)；于手術(shù)后第1、2、4、8周時觀察各組大鼠患肢肌力恢復情況，采用梳洗試驗以及肱二頭肌濕重觀察和評價各組大鼠的屈肘功能；分別于術(shù)后第1、2、4、8周時檢測各組大鼠右側(cè)肌皮神經(jīng)復合動作電位傳導速度(NCV)及右側(cè)肱二頭肌復合動作電位(CMAP)，術(shù)后第8周熒光顯微鏡觀察各組大鼠新生神經(jīng)軸突數(shù)。結(jié)果： 各組大鼠手術(shù)切口均一期愈合，無紅腫及潰瘍發(fā)生；梳洗試驗顯示2周時各組梳洗試驗患肢屈肘活動較差，第4和第8周時組C、D、E屈肘活動有好轉(zhuǎn)；術(shù)后組C、D、E肱二頭肌濕重重于組B，但比組A輕(P<0.05)；術(shù)后組C、D、E肌皮NCV快于組B，但比組A慢(P<0.05)；各實驗組肱二頭肌CMAP波幅較組A低，組C、D、E較組B高(P<0.05)；術(shù)后第8周的神經(jīng)纖維軸突計數(shù)證實組C、D、E新生神經(jīng)纖維軸突數(shù)少于組A，但多于組B(P<0.05)。結(jié)論： 神經(jīng)端-側(cè)移位是治療周圍神經(jīng)損傷的有效方法，局部植入神經(jīng)生長因子、激活態(tài)雪旺細胞、神經(jīng)干細胞均可促進端-側(cè)縫合后神經(jīng)再生。

神經(jīng)外科手術(shù)； 縫合技術(shù)； 神經(jīng)營養(yǎng)因子； 雪旺細胞； 神經(jīng)干細胞

周圍神經(jīng)損傷在臨床上是較為常見的一種損傷，尤其是暴力因素較大而造成神經(jīng)長段缺損，或者在較高平面的神經(jīng)損傷，通常無法直接修復，致使損傷部位以遠肢體的感覺功能喪失、運動與植物功能障礙，造成終身殘疾，嚴重影響患者的工作和生活。為克服周圍神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)功能障礙，已經(jīng)有較多的手術(shù)等治療方法，其中損傷神經(jīng)端-側(cè)縫合自1901年首次報道用于面神經(jīng)斷端與副神經(jīng)側(cè)面縫合治療面癱后，多年鮮有相關(guān)報道[1]。對于神經(jīng)端-側(cè)縫合是否等效于或近似于端-端縫合，實驗結(jié)果是否意味著有效的臨床治療效果，不論在臨床實踐或者實驗研究領(lǐng)域仍有著廣泛的爭論。2012年Haninec等[2]采用端-側(cè)吻合法用腋神經(jīng)修復臂叢損傷，提示損傷神經(jīng)與自體神經(jīng)移植效果相當。本研究在建立神經(jīng)損傷動物模型的基礎(chǔ)上，采用損傷神經(jīng)端-側(cè)縫合組，或局部植入神經(jīng)生長因子、激活態(tài)雪旺細胞和神經(jīng)干細胞，通過形態(tài)學觀察、神經(jīng)電生理和免疫組織化學等方法進行對比，尋找有效的促進神經(jīng)端-側(cè)縫合后損傷神經(jīng)再生的微環(huán)境，為臨床治療高平面周圍神經(jīng)損傷及長段神經(jīng)缺損提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用SD大鼠120只，雌雄不限，體重(250±15)g，由南通大學動物實驗中心提供[合格證號SCXK(蘇)2014-0001]，常規(guī)喂養(yǎng)。隨機分為假手術(shù)組(組A)、肌皮神經(jīng)切斷后端側(cè)縫合至尺神經(jīng)組(組B)、局部植入神經(jīng)生長因子組(組C)、局部植入激活態(tài)雪旺細胞組(組D)以及局部植入神經(jīng)干細胞組(組E)，共5組，每組24只。

1.2 實驗試劑

鼠神經(jīng)生長因子9 000 U(0.018 mg/支)，等滲鹽水90 mL，溶解配置成0.2 mg/L溶液備用，105/mL雪旺細胞及5×106/mL神經(jīng)干細胞均由廈門北大之路生物工程有限公司提供。

1.3 實驗方法

實驗動物以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，取右側(cè)上肢內(nèi)側(cè)縱形切口，暴露肌皮神經(jīng)、尺神經(jīng)，分別將肌皮神經(jīng)和尺神經(jīng)解剖至外、內(nèi)側(cè)束起始處，自距起始段1.5 mm處切除尺神經(jīng)外膜(開窗)，肌皮神經(jīng)自起始段切斷，斷側(cè)縫合至尺神經(jīng)外膜開窗處，以12-0縫線縫合3針，術(shù)后立即分別于組C、D、E端側(cè)縫合處注入0.2 mg/L神經(jīng)生長因子、105/mL雪旺細胞以及5×106/mL神經(jīng)干細胞各1 mL，假手術(shù)組僅暴露肌皮神經(jīng)與尺神經(jīng)，切口內(nèi)放置青霉素鈉粉末預(yù)防感染，以5-0縫線逐層縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)至1、2、4、8周分批處死。

1.4 觀察指標

1.4.1 行為學觀察 自術(shù)后開始每周觀察各組大鼠患側(cè)肢體的肌力恢復情況。將冰水滴于大鼠頭顱頂部皮膚偏實驗側(cè)，大鼠反射性抬高患肢、屈肘抓撓頭頂皮膚，完成梳洗動作。通過觀察大鼠梳洗實驗，評價各組大鼠的屈肘功能恢復情況。

1.4.2 電生理及組織學觀察 術(shù)后1、2、4、8周通過肌電圖檢測肌皮神經(jīng)復合動作電位的傳導速度(nerve conductive velocity，NCV)和肱二頭肌復合動作電位(compound muscle action potential，CMAP)。術(shù)后1、2、4、8周，室溫下麻醉各組大鼠后稱重，取右側(cè)上肢內(nèi)側(cè)縱形切口再次暴露肌皮神經(jīng)，用玻璃分針小心分離神經(jīng)旁增生的結(jié)締組織；完全游離肌皮神經(jīng)后，測CMAP。CMAP測定方法如下，按Suzuki[3]的方法將記錄電極刺入靶肌肱二頭肌肌腹中點處，前上方45°角刺入0.2 cm，干擾電極置于分離開的皮膚上，依次將刺激電極置于肌皮神經(jīng)斷側(cè)縫合口的遠側(cè)和近側(cè)，電擊刺激神經(jīng)，分兩次分別記錄CMAP，測量其波幅。由兩次刺激潛伏期的長短A(mm)和兩次刺激位點的距離B(ms)，A/B可以得到NCV。通過使用熒光顯微鏡觀察端側(cè)縫合后神經(jīng)冰凍切片，計數(shù)新生神經(jīng)纖維軸突數(shù)量、直徑。冰凍切片在磷酸鹽緩沖鹽水中漂洗3次，每次10 min。加封閉液，放入濕盒內(nèi)置于37 ℃恒溫箱內(nèi)1 h。傾去封閉液，不洗。直接加入小鼠抗NF單克隆抗體(Sigma公司)，4 ℃孵育24 h。熒光封片液封片，熒光顯微鏡觀察。術(shù)后稱量實驗側(cè)肱二頭肌濕重，評價不同時間點各組大鼠神經(jīng)纖維的再生情況以及肱二頭肌恢復情況。

1.5 統(tǒng)計學分析

形態(tài)計量分析的數(shù)據(jù)均采用SPSS.22統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患肢活動情況

術(shù)后1周各組大鼠手術(shù)切口均愈合良好，無明顯感染，梳洗試驗顯示各大鼠患肢均有不同程度活動受限；2周時各組梳洗試驗患肢屈肘活動較差，第4周、第8周時組C、D、E屈肘活動有好轉(zhuǎn)。

2.2 神經(jīng)電生理

術(shù)后第1、2、4、8周，組C、D、E肌皮NCV快于組B(P<0.05)，但比組A慢(P<0.05)，組C、D、E間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。各實驗組肱二頭肌CMAP波幅較組A低(P<0.05)，組C、D、E較組B高(P<0.05)。組C、D、E間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

(1)與同時點組A比較，P﹤0.05;(2)與組B比較，P<0.05;(3)組C、D、E兩兩比較，P>0.05

注： A、B、C、D、E分別對應(yīng)組A、組B、組C、組D、組E的CMAP波形，圖中a為縫合口近端CMAP波形，b為遠端波形圖1 術(shù)后8周各組肱二頭肌CMAPFig.1 The CMAP of biceps in each group at 8 weeks after surgery

2.3 肱二頭肌濕重

術(shù)后8周，肉眼可見各組大鼠肱二頭肌均有不同程度萎縮，組B萎縮較為明顯，組C、D、E術(shù)側(cè)肌肉相對柔軟紅潤。術(shù)后第1、2、4、8周，組C、D、E肱二頭肌濕重重于組B(P<0.05)，但比組A組輕(P<0.05)，組C、D、E間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肱二頭肌濕重±s，n=6)Tab.2 Thewet weight of biceps of rats in each group

(1)與同時點組A比較，P<0.05;(2)與組B比較，P<0.05;(3)組C、D、E兩兩比較，P>0.05

2.4 新生神經(jīng)纖維軸突數(shù)量

術(shù)后8周，各組大鼠肌皮神經(jīng)端-側(cè)縫合處遠端免疫組織化學染色顯示，組C、D、E大鼠新生神經(jīng)纖維軸突密集，而組B軸突分布較為稀疏。組C、D、E新生神經(jīng)纖維軸突數(shù)少于組A(P<0.05)，但多于組B(P<0.05)，組C、D、E間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：圖中A、B、C、D、E分別對應(yīng)組A、組B、組C、組D、組E，圖中綠點為神經(jīng)纖維軸突圖2 假手術(shù)組尺神經(jīng)纖維軸突數(shù)量與各實驗組端-側(cè)縫合后新生神經(jīng)纖維軸突數(shù)量Fig.2 Nerve fiber axon number of rats in group A and in group B, C, D, E after end-to-side anastomosis

圖3 組B、C、D、E端側(cè)縫合后神經(jīng)軸突數(shù)量與 組A神經(jīng)軸突數(shù)量的比值Fig.3 The ratio of axon amount in group B,C,D,E and group A after end-to-side anastomosis

3 討論

周圍神經(jīng)損傷是由于周圍神經(jīng)主干或者其分支受到創(chuàng)傷，導致受損神經(jīng)支配的相應(yīng)區(qū)域的運動、感覺及自主神經(jīng)功能障礙的臨床綜合征，在臨床上是較為常見的損傷，周圍神經(jīng)損傷的治療在臨床上是特別棘手的問題[4-5]，尤其是暴力因素造成的神經(jīng)長段缺損，或者在較高平面的神經(jīng)損傷，通常導致無法直接修復。這類神經(jīng)損傷往往采用自體神經(jīng)移植、人工神經(jīng)橋接移植修復，但人體可供移植的神經(jīng)有限，且對供體神經(jīng)有一定損傷，人工神經(jīng)移植物在作用機制及移植時機上仍存較大爭議，且價格較昂貴。周圍神經(jīng)損傷的治療是臨床上的難題，神經(jīng)橫斷后，及時用顯微外科手術(shù)技術(shù)進行斷端吻合是可以取得一定的效果，但是神經(jīng)功能的恢復還不夠理想[6-7]。在20世紀90年代初，有學者提出僅靠提高手術(shù)技術(shù)很難取得突破性的進展。近年來對神經(jīng)營養(yǎng)因子類物質(zhì)促神經(jīng)再生的研究較多，如神經(jīng)生長因子可支持神經(jīng)細胞的發(fā)育、促進神經(jīng)元存活、促進軸突再生、刺激周圍神經(jīng)細胞的生長和分化以及誘導神經(jīng)纖維定向生長等[8-9]。Fansa等[10]將體外培養(yǎng)的雪旺細胞橋接鼠坐骨神經(jīng)缺損,顯著促進了神經(jīng)再生。Torgoe等[11]檢測出雪旺細胞能使周圍神經(jīng)軸突再生速度加快4倍。

本實驗采用損傷肌皮神經(jīng)端-側(cè)縫合至尺神經(jīng)的SD大鼠動物模型，在縫合處局部注射神經(jīng)生長因子，雪旺細胞以及神經(jīng)干細胞的方法，通過行為學、神經(jīng)電生理學、免疫組織化學等指標觀察神經(jīng)再生效果。從表1可見：神經(jīng)傳導速度在1、2、4、8周時各實驗組均慢于假手術(shù)組，各實驗組組間無明顯差異，實驗組比單純縫合組神經(jīng)傳導速度快，說明局部植入神經(jīng)生長因子，激活態(tài)雪旺細胞及神經(jīng)干細胞對神經(jīng)再生有一定促進作用。與第1周時相比，第4周時各實驗組神經(jīng)傳導速度有一定的恢復，第8周時明顯恢復，但均慢于假手術(shù)組。由此可見將大鼠肌皮神經(jīng)端-側(cè)縫合至尺神經(jīng)的方法對神經(jīng)再生有一定效果，但本實驗未與端-端縫合相比較，端-側(cè)縫合效果是否等同于端-端縫合須進一步研究，曹學誠等[12]通過檢測乙酞膽堿轉(zhuǎn)移酶活性的實驗，認為端-側(cè)縫合與端-端縫合相比，神經(jīng)再生能力約為后者的76%～80%，是正常的55%～70%。表2肱二頭肌復合動作電位結(jié)果與表1相似，各實驗組肱二頭肌復合動作電位波幅均低于假手術(shù)組，各實驗組組間無明顯差異，各實驗組肱二頭肌復合動作電位波幅比單純縫合組高，進一步說明局部植入神經(jīng)生長因子，激活態(tài)雪旺細胞及神經(jīng)干細胞對神經(jīng)再生有一定促進作用。與第1周時相比，第4周時有一定恢復，第8周時明顯恢復，但肱二頭肌復合動作電位波幅均低于假手術(shù)組。本實驗中神經(jīng)營養(yǎng)因子、激活態(tài)雪旺細胞及神經(jīng)干細胞濃度變化對端-側(cè)縫合后神經(jīng)再生的影響未作研究，尚須進一步實驗研究不同濃度對端-側(cè)縫合后神經(jīng)再生的作用。有研究表明提高神經(jīng)生長因子濃度可促進軸突再生，而濃度>800 ng/L時則出現(xiàn)抑制作用[13]。

綜上所述，神經(jīng)端-側(cè)移位是治療周圍神經(jīng)損傷的有效方法。局部植入神經(jīng)生長因子、激活態(tài)雪旺細胞、神經(jīng)干細胞均可促進端-側(cè)縫合后神經(jīng)再生，但三者對促進端-側(cè)縫合后神經(jīng)再生的作用無明顯差異。

[1] 芮晶，勞杰.端側(cè)吻合修復周圍神經(jīng)損傷的研究進展[J].中華顯微外科雜志, 2012(3):259-261.

[2] Haninec P, Kaiser R. The end-to-sideneurorrhaphy in axillary nerve reconstruction in patients with brachial plexus palsy[J]. PlastReconstrSurg, 2012(5):882-883.

[3] Suzuki Y, Tanihara M, Ohnishi K, et al. Cat peripheral nerve regeneration across 50mm gap repaired with a novel nerve guidecomposed of freeze dried alglnategel[J]. NeuroseiLett, 1999(2): 75-78.

[4] 王光臨,楊志明,林衛(wèi),等組織工程化人工神經(jīng)修復周圍神經(jīng)缺損的實驗研究[J].中華手外科雜志, 2002(3):134-137.

[5] 顧玉東.周圍神經(jīng)缺損的基本概念與治療原則[J].中華手外科雜志, 2002(3):129-130.

[7] Denis V, Carine A. Transforming growth factor-β signalling in brain disorders[J]. Cytokine & Growth Factor Reviews, 2006(1-2): 121-128.

[8] Sun JQ, Zhou WH. Ischemia induced neural stem cell proliferation and differentiation in neonatal rat involved vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-beta pathways [J] . Brain and Development, 2010(3): 191-200.

[9] D’Ambrosi N, Murra B, Cavaliere F,et al. Interaction between ATP and nerve growth factor signaling in the survival and neuritic outgrowth from PC12 cells[J]. Neuroscience, 2001(3):527-534.

[10]Fansa H, Keilhoff G, Forster G, et al. A cellularmusclewith Schwann cell imp lantation: an alternative biologic nerve conduit[J].J reconstrMicrosurg, 1999(7): 531-537.

[11]Torgoe K. Stimulation and inhibition mechanisms in peripheral nerve regeneration [J]. KaibogaknZasshi, 1999(3):363-371.

[12]曹學成,蔡錦方.周圍神經(jīng)端側(cè)吻合后乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶變化.中華顯微外科雜志, 1999(3):204-206.

[13]Jin J, Limburg S, Joshi SK, et al. Peripheral nerve repair in rats using composite hydrogel-filled aligned nanofiber conduits with incorporasted nerve growth factor[J]. Tissue Eng Part A, 2013(19-20):2138-2146.

(2016-10-22收稿，2016-11-29修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 周 凌

Microenvironment on Nerve Regeneration in Peripheral Nerve Injury after Nerve End to Side Anastomosis

MEI Yuandong1, ZHU Wei1, GU Chen1, GU Yudong2

(1.DepartmentofHandandFootSurgery,theSecondPeople'sHospitalofChangshu,Changshu215500,Jiangsu,China;2.DepartmentofHandSurgery,HuashanHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China)

Objective: To explore the effect of microenvironment on nerve regeneration in peripheral nerve injury after end to side anastomosis. Methods: 120 SD rats were divided into sham operation group (group A), after transection of the right musculocutaneous nerve, end to side anastomosis to the ulnar nerve group (group B), transection of the right musculocutaneous nerve, end to side anastomosis and local implantation of neurotrophic factor group (group C), transection of the right musculocutaneous nerve, end to side anastomosis and local implantation of activated Schwann cells group (group D) , transection of the right musculocutaneous nerve, end to side anastomosis and local implantation of neural stem cells group (group E); 1, 2, 4, 8 weeks after operation, the muscle force recovery condition of affected side limb was observed, and the recovery of elbow flexion function was observed and evaluated by using grooming test, and musculocutaneous nerve conduction velocity (NCV) and muscle compound action potential (CMAP) were detected; Nerve fiber axon number was were observed by fluorescence microscopy in 8 weeks after end to side anastomosis. Results: All the operative incision were healed by first intension without swollen and ulcer. Grooming test showed that elbow flexion function in groups B, C, D,E was relatively bad in 2 weeks after operation, and in 4, 8weeks, the fuction in groups C, D, E improved. NCV, CMAP, biceps wet weight and nerve fiber axon number in groups C, D and E were superior to group B(P<0.05), but worse than group A(P<0.05). There was no significant difference between groups C, D and E(P>0.05).Conclusion: End-to-side anastomosis is an effective method for treating peripheral nerve injury.Locally implanting nerve growth factor, Schwann cells, neural stem cell could facilitate the nerve regeneration.

neurosurgery operation; suture techniques; neurotrophic factor; Schwann cells; neural stem cell

上海市周圍神經(jīng)顯微外科重點實驗室開放課題

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.028.html

R612； R745.1

A

1000-2707(2016)12-1435-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.015

**通信作者 E-mail:guchen6673@126.com