甘草SRAP-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化及引物篩選

艾鵬飛，蘇 姍，靳占忠

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

甘草SRAP-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化及引物篩選

艾鵬飛，蘇 姍，靳占忠

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

為了建立甘草SRAP技術(shù)，采用四因素(Taq酶，Mg2+，dNTP，引物)四水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[L16(44)]對甘草進(jìn)行SRAP-PCR試驗(yàn)，電泳結(jié)果采用軟件SPSS分析，退火溫度和引物篩選采用單因子試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種因素對甘草SRAP-PCR的影響依次為dNTP>Taq酶>Mg2+>引物；優(yōu)化后的甘草SRAP-PCR體系(20 μL)為1×PCR緩沖液，引物0.6 μmol/L，Mg2+2.5 mmol/L，Taq酶 1.5 U，dNTP 0.3 mmol/L，模板DNA 40 ng；最佳的退火溫度為50 ℃；81對引物中有22對擴(kuò)增出明亮、清晰的譜帶。該優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系為進(jìn)行甘草資源遺傳分析提供了技術(shù)支持。

植物遺傳學(xué)；甘草；SRAP；PCR；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；引物篩選

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-relatedamplifiedpolymorphism，SRAP)是基于PCR的一種顯性標(biāo)記，它通過獨(dú)特的雙引物對基因的ORFs(openreadingframes，開放閱讀框)特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增(上游引物17bp，擴(kuò)增外顯子區(qū)域；下游引物18bp，擴(kuò)增內(nèi)含子、啟動(dòng)子區(qū)域)。

由于不同物種、同物種的不同個(gè)體彼此之間的啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子和間隔區(qū)域長度不同，SRAP-PCR的結(jié)果表現(xiàn)出多態(tài)性。相較于其他的分子標(biāo)記(如RAPD，SSR，ISSR，AFLP等)，SRAP具有引物通用性強(qiáng)、操作簡單、PCR產(chǎn)物穩(wěn)定、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)[1]，目前廣泛應(yīng)用于物種鑒定[2]、遺傳多樣性分析[3-4]、遺傳圖譜構(gòu)建[5]、比較基因組學(xué)[6]等方面。

本試驗(yàn)采用L16(44)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[7]，對甘草SRAP-PCR反應(yīng)體系中的4個(gè)因素(Taq酶，Mg2+，dNTP，引物)在4個(gè)水平上進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化甘草的SRAP-PCR體系，為評(píng)價(jià)和利用其種質(zhì)資源提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以本研究小組選育出來的甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)優(yōu)系JA-1(甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.2%)為試材，SRAP引物序列(見表1)由北京賽百盛生物公司合成，dNTP和Taq酶等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1)DNA提取與電泳檢測

CTAB法[8]提取甘草株系JA-1葉片基因組DNA，經(jīng)1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，無菌水稀釋至質(zhì)量濃度為40 ng/μL，-20 ℃冰箱保存。

2)SRAP-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用引物組合M5-E5(表1)對影響SRAP-PCR反應(yīng)的dNTP，Mg2+，引物，Taq酶進(jìn)行四因素四水平的正交L16(44)試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)。在20 μL的PCR反應(yīng)體系中，含有1×PCR 緩沖液和40 ng模板DNA，其他成分含量按表2進(jìn)行，共16個(gè)處理，3次重復(fù)。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，35 ℃復(fù)性45 s,72 ℃延伸1 min，5次循環(huán)；94 ℃變性40 s，50 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸8 min。1.2%瓊脂糖凝膠(添加0.5 μg/mL EB)電泳擴(kuò)增產(chǎn)物后，采用凝膠成像分析儀拍照。基于條帶清晰和帶型豐富程度，電泳圖譜中最佳組合記為16分，其次記15分，依次類推，最差的記1分，統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用軟件SPSS V13.0分析。

3)退火溫度優(yōu)化

基于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出的最佳組合，采用單因子試驗(yàn)對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。退火溫度5個(gè)水平依次為46，48，50，52，54 ℃。

4)SRAP引物篩選

基于試驗(yàn)結(jié)果得出的SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，采用81對SRAP引物組合(見表1)進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證和引物篩選。

表1 SRAP 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果直觀分析

由于Taq酶、引物、dNTP和Mg2+的濃度不同，SRAP-PCR擴(kuò)增的譜帶條數(shù)和清晰度也不同[8]，正如圖1所示的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的SRAP-PCR電泳結(jié)果。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(44)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，極差分析表明4個(gè)因素對SRAP-PCR反應(yīng)的影響大小依次為dNTP濃度、Taq聚合酶量、Mg2+濃度、引物濃度，方差分析(見表3)表明4個(gè)因素彼此之間的差異均表現(xiàn)出顯著性水平(P<0.05)。因此，需要對4個(gè)因素的不同水平進(jìn)行分析，其SRAP-PCR結(jié)果數(shù)值見圖2。

表2 SRAP-PCR 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(44)

注：K1—K4分別表示各因素1—4種水平的結(jié)果平均值；R表示平均值的極差值。

圖1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)SRAP-PCR電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis profiles of SRAP-PCR by orthogonal test design

因素偏差平方和自由度F值顯著性水平P<0．05P<0．01c(dNTP)212．503111．25???c(引物)19．5039．75?Taq酶65．50332．75???c(Mg2+)30．50315．250?

注：* 表示差異顯著；**表示差異極顯著。

圖2 4個(gè)因素對SRAP-PCR 結(jié)果數(shù)值的影響Fig.2 Effects of four factors on the outcoming value in SRAP-PCR

2.2 dNTP濃度對SRAP-PCR結(jié)果數(shù)值的影響

dNTP是PCR反應(yīng)的原料[9]。本試驗(yàn)中，dNTP濃度對SRAP-PCR結(jié)果的影響顯示出極顯著性水平P<0.01(見表3)。由圖2可知，SRAP-PCR結(jié)果數(shù)值隨著dNTP濃度0.10 mmol/L增至0.40 mmol/L時(shí)先增大后減小，且在0.30 mmol/L時(shí)結(jié)果數(shù)值最大，此時(shí)表現(xiàn)出帶型清晰，主帶明顯(見圖1)。應(yīng)東山等[10]認(rèn)為dNTP濃度過高時(shí)會(huì)結(jié)合Mg2+，使得反應(yīng)體系中游離的Mg2+濃度降低。故dNTP最適濃度為0.30 mmol/L。

2.3Taq酶對SRAP-PCR結(jié)果數(shù)值的影響

表3表明，Taq酶對SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響表現(xiàn)出差異極顯著(P<0.01)。如圖2所示，SRAP-PCR結(jié)果數(shù)值隨著Taq酶用量的增加先增大后減小，且為1.5U時(shí)結(jié)果數(shù)值最大。圖1中，Taq酶1.5U時(shí)譜帶清晰、明亮、無雜帶。因此。20μL體系中Taq酶為1.5U時(shí)較好。

2.4 Mg2+濃度對SRAP-PCR結(jié)果數(shù)值的影響

在PCR反應(yīng)體系中，Mg2+是Taq酶的激活劑[10]。圖2表明，Mg2+濃度為1.5 ～3.0 mmol/L時(shí)，SRAP-PCR擴(kuò)增的結(jié)果數(shù)值先增大后減小，且在2.5 mmol/L時(shí)最大。其原因是Mg2+濃度過低時(shí)降低了Taq酶活性，減少了PCR產(chǎn)物量，過高時(shí)引起非特異性擴(kuò)增[10]。故本試驗(yàn)最佳的Mg2+濃度為2.5 mmol/L。

2.5 引物濃度對SRAP-PCR結(jié)果數(shù)值的影響

引物濃度對SRAP-PCR結(jié)果數(shù)值的影響見圖2，當(dāng)引物濃度為0.2 ～0.8μmol/L時(shí)，SRAP-PCR的結(jié)果數(shù)值變化不大，其中引物濃度為0.6μmol/L時(shí)結(jié)果數(shù)值最大。圖1也表明，引物濃度較低時(shí)擴(kuò)增的譜帶(非主帶)較弱，濃度過高時(shí)譜帶信號(hào)強(qiáng)，但同時(shí)背景加深。其原因是引物濃度過低時(shí)影響擴(kuò)增效率，過高時(shí)引起與DNA模板鏈錯(cuò)配產(chǎn)生假陽性條帶[11]。因此，引物濃度可選用0.6μmol/L。

2.6 退火溫度對SRAP-PCR結(jié)果的影響

在PCR反應(yīng)體系中，退火溫度影響引物與DNA模板鏈的特異性結(jié)合[11]。由圖3可知，退火溫度過高或過低時(shí)擴(kuò)增效果都不理想，當(dāng)退火溫度為50 ℃時(shí)，擴(kuò)增出的譜帶清晰、明亮，帶型豐富。因此，適宜的退火溫度為50 ℃。

圖3 不同退火溫度的SRAP-PCR電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis profiles of SRAP-PCR at various annealing temperatures

2.7 SRAP-PCR優(yōu)化體系的驗(yàn)證與引物篩選

采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，對81個(gè)SRAP引物組合(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖4，22對引物表現(xiàn)出了條帶清晰、豐富，表明優(yōu)化后的PCR體系適用于甘草的SRAP分析。篩選出的甘草SRAP引物組合22對(圖4)依次為M1-E9，M2-E2，M2-E4，M3-E4，M3-Em8，Me4-E2，M4-E7，M4-E8，M5-E5，M5-E9，M6-E3，M6-E4，M6-E6，M7-E2，M7-E4，M7-E7，M8-E1，M8-E4，M8-E7，M9-E1，M9-E4，M9-E5。

圖4 22對引物組合的SRAP-PCR電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis profiles of SRAP-PCR with 22 primers combined

3 結(jié) 論

SRAP-PCR的擴(kuò)增結(jié)果受到反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序以及物種特性的影響[10-12]。因此，要獲得條帶清晰、穩(wěn)定的電泳圖譜，需要針對試驗(yàn)材料調(diào)整和優(yōu)化反應(yīng)體系中的不同組分和PCR程序等主要影響因子。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，從復(fù)因子試驗(yàn)中選出有代表性的水平組合進(jìn)行試驗(yàn)，這樣既減少了處理組合數(shù)，又統(tǒng)籌到各因素不同水平間的交互作用，相對于單因素試驗(yàn)和完全組合設(shè)計(jì)更加高效[7，13]。另外，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，采用統(tǒng)計(jì)分析法可有效地考察出各組分不同水平下的差異顯著性，以致試驗(yàn)結(jié)果分析得更加科學(xué)和完善[14]。當(dāng)然，在該方法的直觀分析中，對試驗(yàn)結(jié)果的賦值打分帶有一定的主觀成分，以致影響到最終各因素最佳水平確定的可靠性[15]。在具體試驗(yàn)中，如本研究中通過增加正交試驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)和驗(yàn)證試驗(yàn)來減少直觀因素帶來的負(fù)面影響。

本研究基于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了甘草SRAP-PCR反應(yīng)體系，即在20 μL的反應(yīng)液中，含dNTP 0.3 mmol/L，Taq酶1.5 U，Mg2+2.5 mmol/L，引物0.6 μmol/L，模板DNA 40 ng，1×PCR 緩沖液。通過單因素試驗(yàn)確定了最佳的退火溫度為50 ℃。驗(yàn)證試驗(yàn)和引物篩選結(jié)果表明，該優(yōu)化體系穩(wěn)定、可靠，可以用于甘草的遺傳分析和資源評(píng)價(jià)等研究中。

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Optimization of SRAP-PCR system on Glycyrrhiza uralensis by orthogonal test design and selection of primers

AI Pengfei, SU Shan, JIN Zhanzhong

(School of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

In order to establish the SRAP-PCR technology forGlycyrrhizauralensis, an orthogonal design testing is used to optimize the reaction system of SRAP-PCR with 4 factors (Taqpolymerase, Mg2+, dNTP and primer) at 4 levels, and the electrophoresis profiles are analyzed by software SPSS. The annealing temperature and SRAP primer combinations are selected using the single factor experiment. The results show that effects of the 4 factors on the SRAP-PCR are dNTP,Taqpolymerase, Mg2+and primer in turn. The optimized SRAP-PCR reaction system (20 μL) forG.uralensisis constructed of 1×PCR buffer, 0.6 μmol/L primers, 2.5 mmol/L Mg2+, 1.5 UTaqpolymerase, 0.3 mmol/L dNTP and 40 ng DNA template. The optimized annealing temperature is 50 ℃. Using the optimized system, 22 primer combinations are selected among 81 primer combinations, which produced bright and clear bands. The optimized SRAP-PCR system can provide the technique support for the phylogenetic analysis ofG.uralensis.

plantgenetics；Glycyrrhiza uralensisFisch.;SRAP;PCR;orthogonaltestdesign;primerscreening

1008-1534(2017)01-0007-05

2016-06-05;

2016-11-21；責(zé)任編輯：王海云

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(14237503D-3)

艾鵬飛(1974—)，男，湖北黃岡人，教授，博士，主要從事植物資源評(píng)價(jià)與應(yīng)用方面的研究。

靳占忠教授。E-mail:1820482432@qq.com

Q37

A

10.7535/hbgykj.2017yx01002

艾鵬飛，蘇 姍，靳占忠.甘草SRAP-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化及引物篩選[J].河北工業(yè)科技,2017,34(1):7-11. AI Pengfei, SU Shan, JIN Zhanzhong.Optimization of SRAP-PCR system onGlycyrrhizauralensisby orthogonal test design and selection of primers[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology,2017,34(1):7-11.