高效液相色譜法測(cè)定利咽口服液中綠原酸的含量

荊玉玲

(淄博市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室，山東 淄博 255300)

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高效液相色譜法測(cè)定利咽口服液中綠原酸的含量

荊玉玲*

(淄博市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室，山東 淄博 255300)

目的：建立利咽口服液的質(zhì)量控制方法。方法：采用薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)對(duì)處方中的金銀花和菊花、玄參、麥冬、射干進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)對(duì)利咽口服液中的綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：3批次利咽口服液中金銀花和菊花、玄參、麥冬、射干的TLC斑點(diǎn)清晰，分離度良好，陰性無干擾。綠原酸進(jìn)樣量在0.132 7～1.326 9 μg(r=0.999 8)之間呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為100.44%，RSD為1.14%。結(jié)論：本研究方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠，可用于利咽口服液的質(zhì)量控制。

利咽口服液； 薄層色譜法； 高效液相色譜法； 質(zhì)量控制； 綠原酸

利咽口服液是淄博市中醫(yī)醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱“我院”)自制制劑，由金銀花、菊花、玄參、麥冬、射干等多味中藥提取濃縮而成。該方屬醫(yī)院老中醫(yī)專家經(jīng)驗(yàn)方，具有利咽清喉、清除分泌物，消除異物感、咽痛、咽干、聲音嘶啞的功效，適用于急慢性咽炎、急慢性喉炎及扁桃體炎。利咽口服液為純中藥制劑，并含有15%純蜂蜜，因口感好、見效快、治愈率高的特點(diǎn)，深受患者歡迎。但目前除了綠原酸(金銀花和菊花)薄層色譜方法之外[1]，尚無科學(xué)、可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)用于鑒別利咽口服液。為了確保我院優(yōu)勢(shì)特色制劑的質(zhì)量，提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究對(duì)利咽口服液的質(zhì)量控制方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 材料

1.1 儀器

日本島津LC-20A高效液相色譜儀，LC-20AT輸液泵，串聯(lián)雙柱塞，SPD-20A檢測(cè)器，SIL-20A進(jìn)樣器；島津Innertsil ODS-SDC18柱；上?？普鼙由V成像系統(tǒng)；MS105DU型電子分析天平；KS-500E超聲波清洗機(jī)；HH-S型水浴鍋；Merck硅膠G板、GF254薄層板、聚酰胺薄膜。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201314，純度：96.6%)、哈巴俄苷對(duì)照品(批號(hào)，111730-201106，純度：97.1%)、麥冬對(duì)照藥材(批號(hào)：1211013-201310)均購自中國食品藥品檢定研究院；利咽口服液的樣品和陰性對(duì)照品均由我院制劑室提供，批號(hào)為140709、140719、140729，批準(zhǔn)文號(hào)：魯藥制字Z03080112，每瓶裝250 ml；水為娃哈哈純凈水，乙腈、甲醇為色譜純，其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 金銀花、菊花：將口服液20 ml濃縮至約5 ml，加無水乙醇20 ml，搖勻，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? ml使溶解，作為供試品溶液。另取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照《中華人民共和國藥典·四部》(2015年)通則中薄層色譜法部分，分別吸取供試品和對(duì)照品溶液各3 μl，點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，用36%乙酸展開，取出晾干后，置于紫外光燈365 nm檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照沒有干擾[2]，見圖1(A)。

2.1.2 玄參：將口服液60 ml用乙醚萃取2次，1次30 ml，再用水飽和的正丁醇萃取2次，1次30 ml。正丁醇萃取液合并后，再用正丁醇飽和的水30 ml洗滌，棄去水液，蒸干正丁醇液，加甲醇1 ml溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。另取哈巴俄苷?duì)照品，加甲醇制成1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別吸取供試品和對(duì)照品溶液各5 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用三氯甲烷-甲醇-水(V∶V∶V=12 ∶4 ∶1，下層溶液)作為展開劑，置于展開劑預(yù)飽和15 min的展開缸內(nèi)展開，取出晾干后，用5%香草醛硫酸溶液顯色。結(jié)果供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照沒有干擾[3]，見圖1(B)。

2.1.3 麥冬：取口服液60 ml加入鹽酸3 ml，加熱煮沸5 min，趁熱過濾，濾液放冷后用三氯甲烷萃取2次，1次30 ml，合并三氯甲烷萃取液，蒸干，殘?jiān)萌燃淄? ml溶解，作為供試品溶液。另取1 g麥冬對(duì)照藥材，加水30 ml煎煮10 min，濾過，濾液加鹽酸1 ml，加熱煮沸5 min，趁熱過濾，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別吸取供試品和對(duì)照品溶液各5 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用三氯甲烷-丙酮(V∶V=4 ∶1)展開，取出晾干后，用10%硫酸乙醇溶液顯色。結(jié)果供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照沒有干擾[4]，見圖1(C)。

2.1.4 射干：將口服液60 ml濃縮至30 ml，用三氯甲烷萃取2次，1次30 ml，棄去三氯甲烷液，水液加36%鹽酸2 ml，振搖5 min，用水飽和的正丁醇萃取2次，1次30 ml，將正丁醇萃取液合并后，用正丁醇飽和的水洗滌2次，1次20 ml，棄去水液，蒸干正丁醇液，用甲醇5 ml溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。另取射干?duì)照藥材1 g，加入水30 ml，煎煮10 min，濾過，濾液用三氯甲烷萃取2次，1次30 ml，棄去三氯甲烷液，水液加36%鹽酸1 ml，同法制成對(duì)照藥材溶液。分別吸取供試品和對(duì)照品溶液各10 μl，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，用三氯甲烷-丁酮-甲醇(V∶V∶V=3 ∶1 ∶1)展開，取出晾干后，置于紫外光燈254 nm下檢視。結(jié)果供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照沒有干擾[5]，見圖1(D)。

A.金銀花和菊花(1—3為供試品；4為綠原酸對(duì)照品；5為陰性對(duì)照品)；B.玄參(1—3為供試品；4為哈巴俄苷對(duì)照品；5為陰性對(duì)照品)；C.麥冬(1—3為供試品；4為麥冬對(duì)照藥材；5為陰性對(duì)照品)；D.射干(1—3為供試品；4為射干對(duì)照藥材；5為陰性對(duì)照品)A. Lonicerae japonicae flos and Chrysanthemi flos (1-3 are test samples; 4 is chlorogenic acid reference substance; 5 is negative reference substance); B.Scrophulariae radix (1-3 are test samples; 4 is harpagoside reference substance; 5 is negative reference substance); C. Ophiopogonis radix (1-3 are test samples; 4 is Ophiopogonis radix reference substance; 5 is negative reference substance); D. Belamcandae rhizoma (1-3 are test samples; 4 is Belamcandae rhizoma reference substance; 5 is negative reference substance)圖1 利咽口服液的薄層色譜圖Fig 1 TLC of Liyan oral liquid

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜柱為島津Inertsil ODS-SD C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸溶液(V∶V=10∶90)；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為10 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；柱溫30 ℃。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取綠原酸對(duì)照品17.17 mg，用50%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.331 7 mg/ml的對(duì)照品貯備液。從貯備液中精密量取1 ml置于5 ml棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得到質(zhì)量濃度為66.344 8 μg /ml的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備：精密量取本品2 ml，置于10 ml棕色容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備：取處方中除去金銀花、菊花的其他藥味，按處方比例制成缺金銀花和菊花的陰性對(duì)照口服液。精密量取陰性對(duì)照口服液2 ml，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μl，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，見圖2。綠原酸對(duì)照品的保留時(shí)間為17.561 min，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的位置上，有相應(yīng)色譜峰，綠原酸與其相鄰峰達(dá)到基線分離，分離度為1.507，而陰性對(duì)照色譜中無相應(yīng)色譜峰，說明處方中其他藥味對(duì)綠原酸的含量測(cè)定不產(chǎn)生干擾。

A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液A. reference solution; B. test solution; C. negative reference solution圖2 利咽口服液的高效液相色譜圖Fig 2 HPLC of Liyan oral liquid

2.2.6 線性關(guān)系的考察：分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下適量的綠原酸對(duì)照品貯備液，加入50%甲醇，制成質(zhì)量濃度為13.269 0、33.172 4、66.344 8、99.517 3、132.689 6 μg/ml的一系列溶液。分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以綠原酸對(duì)照品的進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=30 042.6X-78 797.7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。結(jié)果表明，綠原酸進(jìn)樣量在0.132 7～1.326 9 μg之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn)：精密吸取10 μl對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸峰面積的RSD為0.41%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液10 μl(批號(hào)：140709)，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件每3 h進(jìn)樣1次，測(cè)定綠原酸的峰面積積分值，共考察18 h，計(jì)算綠原酸峰面積的RSD為0.90%，結(jié)果表明供試品溶液中綠原酸在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一份供試品(批號(hào)：140709)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，該批口服液中綠原酸的平均含量為0.318 4 mg/ml，RSD為0.93%，提示本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn)：取已測(cè)知含量的本品1 ml(批號(hào)：140709，綠原酸含量為0.318 4 mg/ml)，置于10 ml棕色容量瓶中。精密加入綠原酸對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.331 7 mg/ml)1 ml至上述10 ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算。試驗(yàn)結(jié)果表明本方法的回收率良好，見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

Tab 1 Results of recovery test

編號(hào)取樣量/ml樣品中含量/mg對(duì)照品加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%110 31840 33170 6528100 83210 31840 33170 6584102 51310 31840 33170 6506100 17410 31840 33170 649699 84510 31840 33170 6505100 12610 31840 33170 647499 19100 441 14

2.2.11 樣品含量測(cè)定：取3個(gè)批次(140709，140719，140729)的利咽口服液，每批次各3份，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μl，計(jì)算各批次的綠原酸含量。結(jié)果表明3批次利咽口服液綠原酸含量穩(wěn)定，見表2。

表2 綠原酸含量測(cè)定結(jié)果

Tab 2 Content determination of chlorogenic acid

批號(hào)平均含量/(mg/ml)RSD/%1407090 31850 931407190 32440 921407290 30350 91

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，金銀花和菊花可清熱解毒，疏風(fēng)清熱。藥理研究結(jié)果表明，兩者共有的活性成分為綠原酸，具有抗炎抗菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌及流感病毒有抑制作用，臨床上常用于治療呼吸道感染、流行性感冒、扁桃體炎等[6-8]。為更好地控制制劑質(zhì)量，對(duì)利咽口服液中的綠原酸(君藥金銀花和菊花)進(jìn)行含量測(cè)定[1]，具有重要意義。

在預(yù)試驗(yàn)中，參考了金銀花和菊花中綠原酸的HPLC含量測(cè)定方法，采用乙腈-0.4%磷酸溶液(V∶V=13 ∶87)作為流動(dòng)相[9]。但由于利咽口服液為中藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，干擾大，造成綠原酸的分離效果不理想。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮流動(dòng)相及綠原酸的極性，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了調(diào)整，通過比較乙腈-0.4%磷酸溶液(V∶V=12 ∶88)[10]、乙腈-0.4%磷酸溶液(V∶V=11 ∶89)[11]、乙腈-0.4%磷酸溶液(V∶V=10 ∶90)、乙腈-0.4%磷酸溶液(V∶V=9 ∶91)[12]的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈與0.4%磷酸溶液體積比為10 ∶90時(shí)分離度為1.017，綠原酸對(duì)照品的保留時(shí)間為 17.561 min，陰性幾乎無干擾，效果最好。因此，采用乙腈-0.4%磷酸溶液(V∶V=10 ∶90)作為流動(dòng)相進(jìn)行綠原酸的含量測(cè)定[13-14]。

HPLC測(cè)定3批利咽口服液中綠原酸平均含量為0.315 5 mg/ml?！吨腥A人民共和國藥典·一部》(2015年版)規(guī)定：金銀花按干燥品計(jì)算，含綠原酸不得少于1.5%，菊花含綠原酸不得少于0.20%[15]。考慮回收率等因素，建議標(biāo)準(zhǔn)定為0.300 0 mg/ml。綜上所述，本研究為制定利咽口服液中綠原酸定量指標(biāo)提供了參考依據(jù)，方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確、可靠。

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Content Deterrmination of Chlorogenic Acid in Liyan Oral Liquid by HPLC

JING Yuling
(Dept.of Labouratory, Zibo Traditional Chinese Medicine Hospital, Shandong Zibo 255300, China)

OBJECTIVE：To establish the method for quality control of Liyan oral liquid. METHODS: Thin layer chromatography (TLC) was applied in the qualitative identification of Lonicerae japonicae flos, Chrysanthemi flos, Scrophulariae radix, Ophiopogonis radix, and Belamcandae rhizoma in oral liquid. High performance liquid chromatography (HPLC) was applied in the quantification of chlorogenic acid in Liyan oral liquid. RESULTS: Spots in TLC for Lonicerae japonicae flos, Chrysanthemi flos, Scrophulariae radix, Ophiopogonis radix, and Belamcandae rhizoma from three batches of Liyan oral liquid were clear and had a good separation, and the negative control had no interruption. In HPLC determination, the injection volume and peak area of chlorogenic acid showed good linear relationship (r=0.999 8) within the concentrations of 0.132 7-1.326 9 μg. The average recovery rate was 100.44%，andRSDwas 1.14%. CONCLUSIONS: The established TLC and HPLC methods were simple, precise and accurate, and can be applied in the control quality of Liyan oral liquid.

Liyan oral liquid; TLC; HPLC; Quality control; Chlorogenic acid

R927.2

A

1672-2124(2016)12-1675-03

2016-07-15)

*副主任中藥師。研究方向：制劑標(biāo)準(zhǔn)研究和藥品檢驗(yàn)。E-mail：jingyuling@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.12.035