補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)β-淀粉樣肽25-35損傷的神經(jīng)干細(xì)胞存活及調(diào)亡的影響Δ

肖韓艷，付東瑩，袁春華，馮 瑩，徐甜穎，李 巖

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157000； 2.牡丹江康安醫(yī)院肝病科，黑龍江 牡丹江 157000； 3.牡丹江紅旗醫(yī)院普外科，黑龍江 牡丹江 157000)

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補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)β-淀粉樣肽25-35損傷的神經(jīng)干細(xì)胞存活及調(diào)亡的影響Δ

肖韓艷1*，付東瑩2，袁春華1，馮 瑩1，徐甜穎1，李 巖3#

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157000； 2.牡丹江康安醫(yī)院肝病科，黑龍江 牡丹江 157000； 3.牡丹江紅旗醫(yī)院普外科，黑龍江 牡丹江 157000)

目的：探討補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)β-淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)25-35損傷的神經(jīng)干細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法：取第3代神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞懸液，平均分為阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)模型組、實(shí)驗(yàn)組、拮抗劑組、空白對(duì)照組。AD模型組細(xì)胞加入Aβ25-355 μmol/L制成阿爾茨海默病神經(jīng)干細(xì)胞模型；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入Aβ25-355 μmol/L和補(bǔ)骨脂異黃酮；拮抗劑組細(xì)胞加入Aβ25-355 μmol/L的同時(shí)加入補(bǔ)骨脂異黃酮及雌激素受體拮抗劑；空白對(duì)照組細(xì)胞加入培養(yǎng)液；分別接種于96孔板。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測(cè)補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)Aβ25-35損傷神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響，Western blot法檢測(cè)補(bǔ)骨脂異黃酮干預(yù)后Aβ25-35損傷的神經(jīng)干細(xì)胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性的變化，觀察補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)Aβ25-35損傷神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：MTT法顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度在12、24、48、72 h及7 d均明顯高于AD模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)在1、2、3、7、14、21 d均明顯低于AD模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：補(bǔ)骨脂異黃酮經(jīng)抗凋亡機(jī)制對(duì)Aβ25-35損傷大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，該作用是通過(guò)雌激素受體介導(dǎo)的。

補(bǔ)骨脂異黃酮； β-淀粉樣肽； 神經(jīng)干細(xì)胞； 雌激素受體； 阿爾茨海默病

隨著人口老齡化進(jìn)程加速，老年退行性病變的發(fā)病率逐年升高，中藥在神經(jīng)退行性疾病的防治中取得一定的效果，其有效成分及作用位點(diǎn)是目前的研究熱點(diǎn)。本研究采用補(bǔ)骨脂的提取物，即補(bǔ)骨脂異黃酮，作用于阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)神經(jīng)干細(xì)胞模型，觀察其對(duì)AD神經(jīng)干細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討其可能的作用位點(diǎn)，為此類中藥防治神經(jīng)退行性疾病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生72 h內(nèi)的雄性wistar大鼠。

1.2 儀器與試劑

四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、β-淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ25-35)(Biosouxee公司)；羊抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)多克隆抗體，二抗(中杉金橋)；巢蛋白(Nestin)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；酶標(biāo)計(jì)數(shù)儀E1X800(BioTEK公司)；凝膠成像系統(tǒng)(GelDoe2000型，Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

取出生3 d的Wistar大鼠海馬組織加入培養(yǎng)液，每8 d傳代；行Nestin細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)。Nestin陽(yáng)性證明成功培養(yǎng)大鼠海馬來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞。取第3代神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞懸液，平均分為AD模型組、實(shí)驗(yàn)組、拮抗劑組、空白對(duì)照組。AD模型組細(xì)胞加入Aβ25-355 μmol/L制成AD神經(jīng)干細(xì)胞模型；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入Aβ25-355 μmol/L和補(bǔ)骨脂異黃酮；拮抗劑組細(xì)胞加入Aβ25-355 μmol/L的同時(shí)加入補(bǔ)骨脂異黃酮及雌激素受體拮抗劑；空白對(duì)照組細(xì)胞加入培養(yǎng)液；分別接種于96孔板。上述各組孵育各時(shí)間點(diǎn)(0、12、24、48、72 h、7 d)行MTT檢測(cè)，在不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、2、3、7、14、21 d)行Western blot檢測(cè)。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活率檢測(cè)

培養(yǎng)基中加入MTT溶液，培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基加入二甲基亞砜溶解液，振蕩后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取各組平均值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白對(duì)照組吸光度×100%。

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)各組海馬神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)檢測(cè)

去除培養(yǎng)液，采用磷酸緩沖鹽溶液清洗96孔板后加入細(xì)胞裂解液100 μl，離心后吸取上清液轉(zhuǎn)移入離心管，加入上樣緩沖液電泳，半干轉(zhuǎn)膜，封閉，羊抗鼠Caspase-3多克隆抗體(1∶800)稀釋液在4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加二抗(1∶2 000)稀釋液孵育1.5 h，ECL發(fā)光，感光膠片記錄條帶。應(yīng)用Image J軟件分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)Aβ25-35致傷神經(jīng)干細(xì)胞吸光度的影響

MTT法結(jié)果顯示，在12、24、48、72 h及7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度均明顯高于AD模型組，AD模型組、拮抗劑組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度均明顯低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在48、72 h及7 d時(shí)，拮抗劑組細(xì)胞的吸光度明顯低于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

3.2 補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)Aβ25-35致傷神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響

AD模型組、拮抗劑組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)在1、2、3、7、14、21 d均明顯高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)在1、2、3、7、14、21 d均明顯低于AD模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；拮抗劑組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)與AD模型組相近，見(jiàn)表2。

表1 補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)Aβ25-35致傷神經(jīng)干細(xì)胞吸光度的影響
Tab 1 Effects of posoralen flavonoids on absorbance of Aβ25-35 injured neural stem cells

組別吸光度0h12h 24h 48h 72h 7d 空白對(duì)照組97 21±5 5497 83±4 7598 55±3 8596 42±4 4795 78±5 7694 57±5 18AD模型組92 61±11 7182 89±9 33?65 90±9 99?51 28±8 04?43 01±8 71?23 12±5 41?拮抗劑組91 61±10 5881 43±9 37?67 76±10 56?60 28±11 44?#￥55 26±12 73?#￥31 76±7 15?#￥實(shí)驗(yàn)組91 07±8 6185 38±9 36?#81 36±6 57?#79 54±5 43?#77 74±13 35?#77 18±7 61?#

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與AD模型組比較，#P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較，￥P<0.05

Note：vs. the blank control group,*P<0.05；vs. the AD mode group,#P<0.05；vs. the experimental group,￥P<0.05

表2 補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)Aβ25-35致傷神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)的影響
Tab 2 Effects of posoralen flavonoids on expression of Caspase-3 of Aβ25-35 injured neural stem cells

組別Caspase?3水平0d1d2d3d7d14d21d空白對(duì)照組1 41±0 152 76±0 643 68±0 715 23±1227 72±1 309 22±1 2210 23±1 95AD模型組15 37±2 4417 98±3 34?21 45±2 71?22 73±5 15?25 85±3 50?26 52±1 96?28 92±3 93?拮抗劑組14 63±3 1515 80±3 41?19 15±3 38?20 552±2 38?21 17±3 43?23 56±3 24?24 55±3 46?#實(shí)驗(yàn)組14 11±2 8911 36±3 26?#8 44±0 856?#9 46±1 25?#9 27±2 34?#11 65±3 14?#10 78±3 16?#

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與AD模型組比較，#P<0.05

Note：vs. the blank control group,*P<0.05; vs. the AD mode group,#P<0.05

4 討論

目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，淀粉樣蛋白假說(shuō)是目前影響較廣的假說(shuō)[1]。該假說(shuō)認(rèn)為β蛋白的生成及清除障礙引起Aβ寡聚體沉積形成斑塊[2]，誘發(fā)Tau蛋白的過(guò)度磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)、軸突損傷和突觸丟失等級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3]，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡引發(fā)臨床癥狀。該病無(wú)特效治療方案，神經(jīng)干細(xì)胞因其具有多項(xiàng)分化潛能可應(yīng)用于退行性病變的細(xì)胞作替代治療，有希望成為AD的潛在治療方案，成為目前的研究熱點(diǎn)。本研究建立Aβ?lián)p傷的神經(jīng)干細(xì)胞模型，探討補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)AD損傷神經(jīng)干細(xì)胞的保護(hù)作用，以期為補(bǔ)益類中藥在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的應(yīng)用提供研究依據(jù)[4]。

古方記載補(bǔ)骨脂有補(bǔ)腎壯陽(yáng)之功效，目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其具有擴(kuò)張血管、增加心肌收縮力，抗菌、抗腫瘤、抗衰老，雌激素樣作用等生物活性[5]。本研究采用補(bǔ)骨脂異黃酮作用于AD干細(xì)胞模型以觀察其增殖情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在12、24、48、72 h及7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度均明顯高于AD模型組，AD模型組、拮抗劑組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度均明顯低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在48、72 h及7 d時(shí)，拮抗劑組細(xì)胞的吸光度明顯低于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)Aβ?lián)p傷神經(jīng)細(xì)胞增殖有保護(hù)作用，此作用大部分可被雌激素受體拮抗劑阻斷，提示補(bǔ)骨脂異黃酮的保護(hù)作用主要是由雌激素受體依賴性途徑介導(dǎo)的，受體依賴性途徑指雌激素或調(diào)節(jié)劑進(jìn)入細(xì)胞核與雌激素受體反應(yīng)元件共同調(diào)控效應(yīng)基因的表達(dá)，同時(shí)配體受體復(fù)合物能與其他信號(hào)通路產(chǎn)生交叉反應(yīng)[6]，對(duì)細(xì)胞凋亡增殖等生理活動(dòng)產(chǎn)生影響。補(bǔ)骨脂異黃酮的機(jī)制可能是降低核因子-κB及其在靶基因的表達(dá)[7]，下調(diào)多種酶的基因表達(dá)，上調(diào)創(chuàng)傷后抗調(diào)亡蛋白細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的表達(dá)水平[8]。雌激素的保護(hù)作用還可以通過(guò)雌激素受體非依賴途徑起作用，雌激素受體非依賴性途徑主要集中表現(xiàn)在雌激素及其他雌激素受體調(diào)節(jié)劑的抗氧化活性對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用[9]，如減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的破壞[10]、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。雌激素可以阻止細(xì)胞色素C激活Caspase-3，降低Caspase-3、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl-2)-2基因相關(guān)X蛋白和蛋白激酶B的表達(dá)[11]，下調(diào)這些酶類啟動(dòng)的細(xì)胞調(diào)亡程序。

細(xì)胞凋亡是維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及機(jī)體防御功能和正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的。通過(guò)尸體解剖發(fā)現(xiàn)，AD患者大腦海馬組織凋亡神經(jīng)元明顯多于健康老年人，證明細(xì)胞凋亡參與了AD患者神經(jīng)元退行性病變的過(guò)程[12]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的特征性標(biāo)志之一。本研究的空白對(duì)照組細(xì)胞的Caspase-3檢測(cè)結(jié)果提示了其在正常神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程中也存在凋亡。AD模型組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)隨時(shí)間明顯增加，提示Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，可能是Aβ導(dǎo)致繼發(fā)炎癥反應(yīng)、引起氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞功能、引起線粒體膜電位損失導(dǎo)致細(xì)胞損傷[13]。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)在1、2、3、7、14、21 d均明顯低于AD模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，拮抗劑組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)與AD模型組相近。提示補(bǔ)骨脂異黃酮可以下調(diào)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，且雌激素受體拮抗劑可阻斷其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，而補(bǔ)骨脂異黃酮保護(hù)作用的作用位點(diǎn)在雌激素受體。補(bǔ)骨脂異黃酮的機(jī)制可能是與雌激素受體結(jié)合后誘導(dǎo)的Bcl-2蛋白上調(diào)[14]，在線粒體凋亡中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W起到抑制因子的作用[15]，阻止細(xì)胞色素C的釋放，調(diào)控凋亡下游通路從而阻斷線粒體凋亡通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

[1]李琳，王曉良，彭英.抗阿爾茨海默病天然產(chǎn)物及其藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2016，32(2):149-155.

[2]侯佳寧，胡雅兒.阿爾茨海默病淀粉樣肽級(jí)聯(lián)假說(shuō)及其相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2009，25(1):111-114.

[3]雷曦，王健輝，程肖蕊，等.防治阿爾茨海默病多靶點(diǎn)藥物研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2016，43(2):205-215.

[4]孔祥怡，石鍇，趙晴.阿爾茨海默病血液標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2016，36(5):1260-1263.

[5]曹金一，劉京晶，黃文華，等.補(bǔ)骨脂藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床，2008，24(6):89-92.

[6]劉光偉，龔守良.細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究進(jìn)展[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，30(3):485-488.

[7]Maubach G，Lim MC，Chen J，et al.miRNA studies in in vitro and in vivo activated hepatic stellate cells[J].World J Gastroenterol，2011，17(22)：2748-2773.

[8]Shan B，Li W，Yang SY，et al.Estrogen up-regulates MMP2/9 expression in endometrial epithelial cell via VEGF-ERK1/2 pathway[J].Asian Pac J Trop Med，2013，6(10)：826-830.

[9]黃穎，周艷華，崔海峰，等.雌激素調(diào)節(jié)作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7(5):7-8，11.

[10] Zhu HL，Nie HJ，Li PB，et al.The physiological effects of resveratrol and its potential application in high altitude medicine[J].Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi，2015，31(6):498-503.

[11] Zhang H，Qian Y，Liu Y，et al.Celastrus orbiculatus extract induces mitochondrial-mediated apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells[J].J Tradit Chin Med，2012，32(4):621-626.

[12] 楊怡，王姍姍，魏爾清，等.自噬在神經(jīng)突起變性過(guò)程中的作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2015，29(2):191-201.

[13] 方敏，王曉東.細(xì)胞凋亡的線粒體通路[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2002，34(1):1-10.

[14] Peng Y，Jiang B，Wu H，et al.Effects of genistein on neuronal apoptosis,and expression of Bcl-2 and Bax proteins in the hippocampus of ovariectomized rats[J].Neural Regen Res，2012，7(36):2874-2881.

[15] 蔣建偉，吳風(fēng)云，何金花，等.靶向Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、A1反義核酸抑制消化系腫瘤細(xì)胞增殖效果的差異[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(8):1093-1098.

Effects of Psoralen Flavonoids onβ-amyloid25-35Neural Stem Cell Proliferation and ApoptosisΔ

XIAO Hanyan1, FU Dongying2, YUAN Chunhua1, FENG Ying1, XU Tianying1, LI Yan3
(1.Dept.of Neurology, the Second Affiliated Hospital of Mudanjiang Medical University, Heilongjiang Mudanjiang 157000, China; 2.Dept.of Liver Disease, Mudanjiang Ankang Hospital, Heilongjiang Mudanjiang 157000, China; 3.Dept.of General Surgery, Mudanjiang Red Flag Hospital, Heilongjiang Mudanjiang 157000, China)

OBJECTIVE：To probe into the effects of psoralen flavonoids on β-amyloid Aβ25-35neural stem cell proliferation and apoptosis. METHODS: The third generation of neural stem cell suspension was extracted to be divided into alzheimer disease(AD) mode group, experimental group, antagonist group and blank control group. Aβ25-355 μmol/L was added into AD mode group cells to establish neural stem cells model of alzheimer’s disease; Aβ25-355 μmol/L and psoralen flavonoids were added into experimental group cells; Aβ25-355 μmol/L, psoralen flavonoids combined with estrogen receptor antagonism were added into antagonist group cells; solution was added into the blank control group cells; respectively inoculated into a 96-pore plate. Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) method was adopted to detect the effects of psoralen flavonoids on Aβ25-35injured neural stem cell proliferation, Western blot was adopted to detect the changes of Caspase-3 activity after the intervention of psoralen flavonoids; and effects of psoralen flavonoids on Aβ25-35injured neural stem cells apoptosis. RESULTS: According to MTT, the absorbance of experimental group cells were significantly higher than that of AD mode group in 12 h, 24 h, 48 h, 72 h and 7 d the difference was statistically significant(P<0.05). The expression of Caspase-3 of experimental group were significantly lower than that of AD mode group in 1 d, 2 d, 3 d, 7 d, 14 d and 21 d, the difference was statistically significant(P<0.05). CONCLUSIONS: Psoralen flavonoids can provide protect effects on Aβ25-35injury rat hippocampus neural stem cells by anti-apoptotic mechanisms, the effects are induced by estrogen receptor.

Psoralen flavonoids; β-amyloid; Neural stem cells; Estrogen receptor; Alzheimer’s disease

牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.ZS201521)

R96

A

1672-2124(2016)12-1613-03

2016-08-08)

*主治醫(yī)師。研究方向：神經(jīng)病學(xué)。E-mail：8198xhy@163.com

#通信作者：主治醫(yī)師。研究方向：神經(jīng)干細(xì)胞。E-mail：liyan2030@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.12.010