不同癲癇發(fā)作類(lèi)型發(fā)作間期和發(fā)作后血清ATP ADP及AMP水解率的動(dòng)態(tài)變化

吳艷芝 喬 芳 趙美英 李海靜 張雪蓮 滕軍放(通訊作者)

1)鄭州大學(xué)附屬中心醫(yī)院 鄭州 450042 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450000

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不同癲癇發(fā)作類(lèi)型發(fā)作間期和發(fā)作后血清ATP ADP及AMP水解率的動(dòng)態(tài)變化

吳艷芝1)喬 芳1)趙美英1)李海靜1)張雪蓮1)滕軍放2)(通訊作者)

1)鄭州大學(xué)附屬中心醫(yī)院 鄭州 450042 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450000

目的 探討不同癲癇發(fā)作類(lèi)型發(fā)作間期和發(fā)作后血清ATP、ADP和AMP水解率的變化。方法 選擇2014-03—2015-12我院神經(jīng)內(nèi)科收治的癲癇患者65例(全面性發(fā)作組33例，復(fù)雜部分性發(fā)作組32例)，收集同期在我院門(mén)診進(jìn)行常規(guī)體檢的正常人員35例為健康對(duì)照組，采用紫外線吸收分光光度法，觀察病例組癲癇發(fā)作后5、10、20、30、60 min和10 h時(shí)的ATP、ADP和AMP水解率變化情況，并與健康對(duì)照組比較；觀察全面性發(fā)作組和復(fù)雜部分性發(fā)作組癲癇發(fā)作后5、10、20、30、60 min和10 h時(shí)的ATP、ADP和AMP水解率變化情況，并進(jìn)行比較；采用SPSS 21.0 版本統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果 病例組發(fā)作間期ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；發(fā)作后5min時(shí)ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率均明顯升高，其中ATP水解率在發(fā)作后20 min達(dá)峰值，之后逐漸下降，至發(fā)作后10 h恢復(fù)至發(fā)作間期水平；ADP水解率、AMP水解率在發(fā)作后5 min達(dá)峰值，隨后逐漸下降，至發(fā)作后60 min即恢復(fù)至發(fā)作間期水平；全面性發(fā)作組和部分性發(fā)作組相比，癲癇發(fā)作后5 min，20 min血清ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率升高更為顯著(P<0.05)。結(jié)論 癲癇發(fā)作后腺苷酸水解率明顯升高，全面性發(fā)作患者與部分性發(fā)作患者相比，腺苷酸水解率升高更為明顯。

癲癇發(fā)作；三磷酸腺苷二磷酸水解酶；胞外三磷酸腺苷酶；5’-核苷酸磷酸二酯酶；胞外-5’-核苷酸酶

癲癇是所有神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的五大難治性疾病之一，全世界有數(shù)千萬(wàn)癲癇患者，如果得不到有效控制，癲癇反復(fù)發(fā)作給患者和家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。大腦神經(jīng)元異常放電是各種癲癇發(fā)作的病理基礎(chǔ)，任何引起腦神經(jīng)元異常放電的因素都可誘發(fā)癲癇發(fā)作[1]。近期，許多學(xué)者對(duì)癲癇病因、發(fā)病機(jī)制及病理改變和治療方法進(jìn)行了研究，并取得了較大進(jìn)展。目前普遍認(rèn)為，癲癇發(fā)生與突觸重塑、神經(jīng)遞質(zhì)受體、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、離子通道、遺傳因素、苔蘚纖維發(fā)芽等多方面均密切相關(guān)[2]。但癲癇發(fā)作的詳細(xì)機(jī)制尚未明確，癲癇每次的發(fā)作是如何開(kāi)始和如何終止的，具體的機(jī)制也未見(jiàn)明確闡明。

近期研究表明，腺苷系統(tǒng)是腦組織中十分重要的抗癲癇和腦保護(hù)系統(tǒng)。腺苷系統(tǒng)主要通過(guò)腺苷與G蛋白偶聯(lián)腺苷受體結(jié)合發(fā)揮作用來(lái)抑制腦組織內(nèi)的神經(jīng)元活性，急性癲癇發(fā)作后早期腺苷水平顯著升高，發(fā)作后一段時(shí)間腺苷恢復(fù)原有水平，因而，該系統(tǒng)被視為“內(nèi)源性抗癲癇系統(tǒng)”。人血循環(huán)中存在可溶性核苷酸，這是血清具有水解腺苷酸作用的基礎(chǔ)，特別是ATP在可溶性磷酸二酯酶作用下生成AMP和無(wú)機(jī)焦磷酸，ADP在三磷酸腺苷二磷酸水解酶(NTPDase)作用下生成AMP和無(wú)機(jī)磷酸，而AMP在可溶性5’-核苷酸酶作用下水解生成腺苷[3]。目前，癲癇發(fā)作后，患者血清ATP、ADP及AMP水解率改變的相關(guān)報(bào)道比較少見(jiàn)。不同癲癇發(fā)作類(lèi)型的血清ATP、ADP及AMP水解率改變是否相同未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定不同癲癇發(fā)作類(lèi)型發(fā)作前后不同時(shí)間點(diǎn)血清ATP、ADP及AMP水解情況，以探討腺苷酸酶活性與癲癇發(fā)作的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集2014-03—2015-12我院神經(jīng)內(nèi)科收治的癲癇患者65例，男40例，女25例；年齡12～69(30.5±10.4)歲；病程2～35(9.1±2.8)a；特發(fā)性癲癇5例，癥狀性癲癇28例，隱源性癲癇32例；全面性發(fā)作33例，部分性發(fā)作32例(包括簡(jiǎn)單部分性發(fā)作19和復(fù)雜部分性發(fā)作13例)，其中全面性發(fā)作主要指全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作，不包括失神發(fā)作、肌陣攣發(fā)作等；抗癲癇藥物單藥治療24例，聯(lián)合治療41例。所有患者進(jìn)行24 h動(dòng)態(tài)腦電圖檢查，監(jiān)測(cè)癲癇發(fā)作的電生理特征，同時(shí)行頭顱MRI檢查。排除有傳染病或炎癥性疾病、肝腎功能不全、腎上腺皮質(zhì)或下丘腦垂體異常疾病、代謝性疾病、心血管疾病、急性嚴(yán)重的神經(jīng)疾??；排除偏頭痛、暈厥、熱性驚厥、短暫性腦缺血以及不能確定為癲癇的其它發(fā)作性事件。另外收集同期在我院門(mén)診進(jìn)行常規(guī)體檢的正常人員35例為健康對(duì)照組，均無(wú)癲癇、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病等，其中男21例，女14例，年齡13～68歲(25.6±7.82)歲。各組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1．2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟(ILAE)2005年提出的癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)：癲癇是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是腦組織存在持續(xù)的引起癲癇反復(fù)發(fā)作的易患性因素，及因這種發(fā)作而產(chǎn)生神經(jīng)生物、認(rèn)知、心理和社會(huì)的后果，癲癇確診需癲癇發(fā)作≥2次，而且結(jié)合病史、腦電圖、影像學(xué)等由癲癇專(zhuān)科醫(yī)師診斷。

1．3 方法

1．3．1 試驗(yàn)試劑和試驗(yàn)儀器：ATP(上海鼓臣生物技術(shù)有限公司)，ADP(上海鼓臣生物技術(shù)有限公司)，AMP(上海鼓臣生物技術(shù)有限公司)，三羥甲基氨基甲烷(上海純優(yōu)生物科技有限公司)，三氯醋酸(上海江萊生物技術(shù)有限公司)，分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)，PH計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)。

1．3．2 標(biāo)本采集：待測(cè)者均在早晨晨起抽取空腹肘部靜脈血5 mL，抽血前安靜休息 60 min。癲癇患者在肘部靜脈處留置靜脈針，第一次采血前12 h無(wú)癲癇發(fā)作，癲癇發(fā)作后5、10、20、30、60 min和10 h分別采集血樣5 mL。并用標(biāo)簽標(biāo)記好每個(gè)血樣試管。將血樣置于室溫下30～60 min后，4℃離心15 min(3 000 r/min)，獲得上層血清加入Eppendorf管，置于70℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．3 ATP、ADP和AMP水解率的測(cè)定：根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料提出的ATP、ADP、AMP水解率測(cè)定法(紫外吸收分光光度法)測(cè)定。即將內(nèi)含5 mmol/L 二氯化鈣和44 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液175 μL，調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入血清5μl，在37℃下培育10 min。加入ATP或ADP或AMP(測(cè)定AMP時(shí)調(diào)節(jié)pH至7.2)10 μL，使其濃度為1.0 mmol/L，在37℃下培育10 min，加入10%三氯醋酸200 μL終止反應(yīng)，放置于630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每個(gè)血樣均測(cè)定3次，計(jì)算每1 mL血清每分鐘釋放的無(wú)機(jī)磷酸鹽(nmol)量即為酶活性。

2 結(jié)果

2．1 腦電圖檢測(cè)情況 65例癲癇患者均行24 h動(dòng)態(tài)腦電圖檢測(cè)，其中48例可見(jiàn)癲癇樣放電波，包括棘波、尖波、尖慢綜合波、多棘波、棘慢綜合波、多棘慢綜合波，余下17例無(wú)癲癇樣放電波。顱腦MRI檢查有26例發(fā)現(xiàn)異常，其中7例腦內(nèi)軟化灶，12例腦萎縮，4例海馬硬化，其他顱內(nèi)病變3例。65例癲癇患者中，顱腦外傷史7例，顱腦手術(shù)史2例，腦血管史4例，顱內(nèi)感染史7例。

2．2 全面性發(fā)作組不同時(shí)間點(diǎn)ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率變化與部分性發(fā)作組ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率比較情況 全面性發(fā)作組在發(fā)作間期ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率與部分性發(fā)作組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；發(fā)作后5min全面性發(fā)作組較部分性發(fā)作組ATP水解率、ADP水解率、AMP水解率均明顯升高，其中ATP水解率在發(fā)作后20 min達(dá)峰值，之后逐漸下降，至發(fā)作后10 h恢復(fù)至發(fā)作間期水平；ADP水解率、AMP水解率在發(fā)作后5min達(dá)峰值，隨后逐漸下降，至發(fā)作后60 min即恢復(fù)至發(fā)作間期水平。見(jiàn)表1、圖1、圖2、圖3。

表1 2組不同時(shí)間點(diǎn)ATP水解率、ADP水解率、 AMP水解率變化比較

注：與部分性發(fā)作組比較，▲P<0.05

圖1 全面性發(fā)作和部分性發(fā)作后ATP水解率不同時(shí)間點(diǎn)變化情況比較(nmol/mL·min)

患者發(fā)作后5 min，ATP水解率明顯升高，發(fā)作后20 min達(dá)峰值，發(fā)作后60min時(shí)仍高于發(fā)作間期，發(fā)作后10 h恢復(fù)至發(fā)作間期水平。全面性發(fā)作組癲癇發(fā)作后ATP水解率明顯高于部分性發(fā)作組(P<0.05)。

圖2 全面性發(fā)作和部分性發(fā)作后ADP水解率在不同時(shí)間點(diǎn)變化情況(nmol/mL·min)

患者發(fā)作后5 min，ADP水解率明顯升高且達(dá)峰值，隨后逐漸降低，發(fā)作后60 min 時(shí)恢復(fù)至發(fā)作間期水平；全面性發(fā)作組癲癇發(fā)作后ADP水解率明顯高于部分性發(fā)作組(P<0.05)。

圖3 全面性發(fā)作和部分性發(fā)作后AMP水解率在不同時(shí)間點(diǎn)變化情況(nmol/mL·min)

患者發(fā)作后5 min，AMP水解率明顯升高且達(dá)峰值，隨后逐漸降低，發(fā)作后60 min 時(shí)恢復(fù)至發(fā)作間期水平；全面性發(fā)作組發(fā)作后AMP水解率明顯高于部分性發(fā)作組。

3 討論

腺苷酸如ATP、ADP、AMP及其衍生物腺苷(ADO)在某些生理和病理過(guò)程中均為重要的信號(hào)分子。據(jù)報(bào)道，腺苷既是一種有效的抗驚厥劑，又有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。單嶠等[4]對(duì)用致驚厥藥誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作間期和發(fā)作時(shí)的大鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)作早期海馬內(nèi)腺苷水平明顯增高，提示癲癇可引起大鼠海馬對(duì)腺苷的釋放增加，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腺苷A1受體激動(dòng)劑和腺苷可有效保護(hù)急性注射戊四氮誘發(fā)癲癇發(fā)作的大鼠，防止其癲癇發(fā)作。以上研究結(jié)果均提示內(nèi)源性腺苷可能有抗驚厥和保護(hù)神經(jīng)作用。實(shí)驗(yàn)表明，癲癇發(fā)作可使腦組織腺苷濃度增加，在大多數(shù)病理?xiàng)l件下，和人體血循環(huán)中腺苷濃度急速增加相關(guān)[5]。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠海馬和腦皮質(zhì)突觸小體內(nèi)出現(xiàn)ATP二磷酸水解酶和5’-核苷酸酶活性增強(qiáng)[6]。腺苷還可通過(guò)突觸前A1受體抑制各種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，特別是興奮性谷氨酸的釋放，來(lái)抑制神經(jīng)元的活性，這是其抑制神經(jīng)活性的第2個(gè)途徑[7]。

根據(jù)本研究結(jié)果，癲癇患者發(fā)作后血清ATP、ADP、AMP水解率明顯升高，推測(cè)可能是通過(guò)增加具有抗驚厥作用的腺苷含量而使癲癇發(fā)作終止，由于目前大多數(shù)癲癇發(fā)作無(wú)法被醫(yī)生所預(yù)見(jiàn)，且暈厥、假性癲癇發(fā)作與癲癇發(fā)作難以鑒別，故通過(guò)測(cè)定患者血清ATP、ADP、AMP水解率可能利于臨床癲癇發(fā)作的診斷和鑒別診斷。本研究還發(fā)現(xiàn)，全面性發(fā)作組和復(fù)雜部分性發(fā)作組患者相比，ATP、ADP和AMP的水解率均顯著升高；進(jìn)一步推測(cè)作用于腺苷酸酶靶點(diǎn)的藥物可能對(duì)全面性發(fā)作更為有效。

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(收稿2016-07-11)

R743.33

A

1673-5110(2016)24-0047-03