PRL腺瘤患者外周血Th17含量及IL-17表達與PRL水平的關系

孟慶軍 孟 磊 金保哲 時會敏 周文科△

1)鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450004 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 衛(wèi)輝 456300

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PRL腺瘤患者外周血Th17含量及IL-17表達與PRL水平的關系

孟慶軍1)孟 磊2)金保哲2)時會敏1)周文科2)△

1)鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450004 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 衛(wèi)輝 456300

目的 探討Th17(helper T lymphocyte，Th17)細胞含量及白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)在垂體泌乳素腺瘤外周血中的表達水平與泌乳素分泌水平的關系。方法 采用流式細胞術檢測24例不同泌乳素水平的PRL(prolacin，PRL)腺瘤患者術前、術后和16例健康體檢者外周血中Th17細胞含量，RT-PCR技術檢測2組外周血中IL-17 mRNA的表達情況并行統(tǒng)計學分析。結果 流式細胞術結果顯示，泌乳素腺瘤患者術前外周血Th17細胞比例(3.49±0.51)%，高于正常對照組(0.86±0.13)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨泌乳素增高程度而增加；RT-PCR結果顯示，泌乳素腺瘤患者術前IL-17 mRNA表達水平(19.43±3.14)%，高于術后的(8.91±1.92)%及正常對照組的(2.69±0.69)%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨泌乳素增高程度而增加。結論 Th17細胞及IL-17在垂體泌乳素腺瘤外周血中的表達與泌乳素的分泌水平呈正相關，可作為評價PRL腺瘤治療效果及預后的指標。

垂體瘤；泌乳素；Th17；IL-17

垂體泌乳素腺瘤是顱內(nèi)常見的良性腫瘤，好發(fā)于青年女性，近年來有增多的趨勢，嚴重損害病人生長、發(fā)育、勞動能力、生育功能，威脅病人身心健康，但其病因及發(fā)病機制至今尚不完全清楚[1-2]。泌乳素腺瘤常以泌乳素升高為特征，泌乳素是一種小分子量蛋白，在機體應激反應時或孕婦妊娠后期表達量增高，PRL與其受體結合后可發(fā)揮多種生物學功能，如維持泌乳、生殖、發(fā)育、神經(jīng)調(diào)節(jié)等[3-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，PRL對免疫具有重要的調(diào)節(jié)作用，免疫系統(tǒng)表達PRL-R(tprolacin-receptor)和分泌PRL，PRL通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌方式調(diào)節(jié)機體的細胞免疫和體液免疫，維持正常免疫功能。研究還發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性淋巴細胞Tregulate cells(Treg)，尤其Th17細胞及其分泌的白細胞介素IL-17輔助體內(nèi)的抗瘤免疫，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用[5-7]。本研究采用流式細胞術、RT-PCR兩種不同的方法分別對不同PRL水平患者外周血的Th17細胞及其IL-17表達進行檢測，與健康對照組比較，分析其水平變化所可能產(chǎn)生的意義，以期能為高分泌型泌乳素垂體腺瘤診斷和治療探尋新的靶點。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院和鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2012-04—2013-03經(jīng)手術后病理證實的24例垂體泌乳素腺瘤患者。診斷均符合王忠誠神經(jīng)外科學垂體泌乳素腺瘤的標準[1]。24例均為女性，年齡19～65歲。根據(jù)對泌乳素腺瘤患者組外周血血清PRL定量自測結果進行分組：>400 μg/L 13例定為術前高度組，399～200 μg/L 6例定為術前中度組，PRL 199～100 μg/L 5例定為術前低度組。正常對照組16例，為本院健康體檢者，均為女性，年齡24～60歲，PRL均在正常范圍內(nèi)。

24例垂體泌乳素腺瘤患者外周血標本均在入院術前留樣(未經(jīng)任何治療)及術后1個月復查時抽取。正常對照組采取血樣前告知患者血樣用途后，患者同意并簽署知情同意書。以無菌方式采集各實驗對象晨起空腹靜脈血5 mL，分為2份，1份4 mL，加EDTA抗凝劑，立即分離淋巴細胞用于Th17細胞因子IL-17的RT-PCR檢測；1份 1 mL，采用肝素鈉抗凝，用于細胞培養(yǎng)后的Th17細胞流式細胞儀檢測。

1．2 主要試劑 抗人CD4-PE抗體(eBioscience)、抗人CD3-FITC抗體(eBioscience)、抗人IL-17-Alexa Fuor抗體(eBioscience)、細胞內(nèi)細胞因子檢測穿膜固定劑(BD)、抗人CD4抗體(eBioscience)人類CD4+T細胞富集試劑盒(eBioscience)、淋巴細胞分離液(Fico11)Trizo1(上海生工)、 RNA 提取試劑盒(Takara)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒(Takara)、 GAPDH、IL-17引物(上海生工)、PCR Marker 1(TIANGEN公司)等。

1．3 實驗方法 流式細胞術檢測TH17細胞的含量：活化外周血中的CD4細胞洗滌后加入5 μL anti-human CD4-PE(抗人IgG抗體)、5 μL anti-human CD3-FITC(抗人IgG抗體)；同時設同型對照組，分別加入5 μL PE、FITC同型對照(鼠抗人IgG1κ)，室溫避光反應30 min。加入1 mL紅細胞裂解液，置室溫10 min，以5 mL PBS重復洗滌1次，棄去上清。透膜后加入加入5 μL抗人IL-17-Alexa Fuor抗體，同型對照組加入5 μL Alexa Fuor同型對照(鼠抗人IgG1κ)，反應洗滌后上機檢測，結果用Cell quest分析軟件分析處理。

RT-PCR檢測檢測IL-17的含量：富集離心提取單個核細胞，加入抗人CD3抗體和50 ng/mL PMA刺激培養(yǎng)4 h后細胞，然后進行RNA提取，檢測RNA提取純度后進行逆轉(zhuǎn)錄及擴增反應，然后進行瓊脂糖電泳，拍照，利用Band Leader 2.0 全自動凝膠圖象分析系統(tǒng)進行 PCR產(chǎn)物灰度分析并記錄結果，測定電泳條帶的灰度值。以目的基因IL-17條帶除以GAPDH條帶灰度比值作為統(tǒng)計量。

2 結果

2．1 Th17細胞(雙陽性細胞)所占外周血CD4+T細胞比例比較 流式細胞儀結果：Th17細胞(雙陽性細胞)所占外周血CD4+T細胞的比例在正常組中較低。在泌乳素腺瘤中Th17細胞(雙陽性細胞)所占外周血CD4+T細胞的比例相對較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著PRL腺瘤患者的泌乳素分泌水平的升高而增加。Spearman等級相關性分析顯示，外周血TH17細胞含量與泌乳素表達量呈正相關(r=0.698，P<0.01)。見表1。

表1 Th17細胞(雙陽性細胞)所占外周血CD4+T 細胞比例比較

注：與正常對照組比較，★P<0.05；高度組、中度組和低度組兩兩之間比較，●P<0.05；與術前比較，☆P<0.05；與正常對照組比較，△P<0.05

2．2 IL-17基因的RT-PCR檢測結果 GAPDH基因擴增產(chǎn)物位于540 bp附近，為所設計的內(nèi)參條帶，在所有標本中表達均條帶單一、較亮。IL-17 cDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶位于400 bp附近，為所要目的條帶，在各例標本中均有表達且條帶清晰。各組的IL-17 擴增條帶灰度有顯著差異，其中各級PRL腺瘤術前及術后較明亮，正常對照組較暗。見圖1。

圖1 PCR擴增IL-17A的電泳圖M：Marker1，1 、2 正常對照組，3 、4 、5 泌乳素瘤患者術前，6、7、8 同一患者術后

2．3 IL-17基因mRNA在泌乳素瘤和正常對照組中的表達 Spearman等級相關性分析顯示，外周血IL-17表達量與泌乳素表達量呈正相關(r=0.653，P<0.01)。見表2。

表2 IL-17基因mRNA在泌乳素瘤和正常 對照組中的表達

注：與正常對照組比較，★P<0.05，△P<0.05；高度組、中度組和低度組兩兩之間比較，P<0.05；與術前每組比較，☆P<0.05

3 討論

Thl7細胞及其因子IL-17一直被認為是促炎因子，近期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者與健康對照相比，其外周血中Thl7細胞比例增高，且Th17增高的程度與腫瘤惡性程度相關[8-9]。胃癌患者依據(jù)TNM分期，Ⅳ期的癌癥患者外周血Th17比例高于Ⅰ期，且腫瘤周圍的引流淋巴結中Th17細胞水平也增加。腫瘤患者組織中與Th17相關的因子，如IL-17、IL-23、P19、RORc的 mRNA表達水平與正常人相比顯著增高[10-11]。在肝細胞癌癌細胞內(nèi)與非腫瘤部位相比較，Th17的水平也是升高的[12-13]，所以，研究者認為Th17細胞或許促進了腫瘤病理發(fā)展。

本試驗通過對垂體PRL腺瘤外周血細胞內(nèi)因子轉(zhuǎn)錄水平及細胞流式技術進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，PRL腺瘤IL-17 mRNA 表達水平與正常對照組及術后對照組均有顯著升高。且隨著泌乳素升高，IL-17 mRNA 表達水平隨之升高，其含量與泌乳素表達量等級呈正相關。流式術檢測結果顯示，PRL腺瘤與術后及正常對照組相比，泌乳素腺瘤患者組外周血Th17細胞比例明顯升高，且隨泌乳素增高程度而增加，結果與 RT-PCR 相似，其含量與泌乳素表達量等級呈正相關。

上述結果表明，垂體PRL腺瘤發(fā)生發(fā)展與機體的Th17細胞亞群的比例相關，Th17通過分泌IL-17可能參與了腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展。PRL是一個重要的免疫調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)機體的淋巴細胞功能和狀態(tài)，維持正常免疫功能，泌乳素水平升高會促發(fā)細胞免疫應答水平的升高，包括Th17介導應答的水平的提升。因此我們認為，PRL腺瘤外周血Th17及其因子IL-17的顯著上升是與高水平的PRL 密切相關的，IL-17升高可以選擇性上調(diào)一些血管源性因子的產(chǎn)生，可能促進PRL腺瘤相關的新血管的形成，使PRL腺瘤體內(nèi)微血管的數(shù)量和密度顯著增加，加劇了PRL腺瘤的生長及復發(fā)[14]。因此我們認為，PRL、Th17和IL-17在泌乳素腺瘤的產(chǎn)生中可能存在這樣一個關系：泌乳素腺瘤導致PRL分泌量的增加，PRL分泌量的增高誘導Th17活化、增殖、浸潤，Th17數(shù)量增加及激活將使炎癥因子分泌增加，特別是IL-17水平的升高，IL-17促進了腫瘤血管的增生，使腫瘤進一步惡化。在泌乳素垂體腺瘤PRL、Th17和IL-17之間形成正反饋調(diào)節(jié)。

本研究提示，機體外周血中Th17和IL-17水平可作為評價PRL腺瘤患者的手術治療效果的一個重要參考指標，如PRL腺瘤外周血中Th17細胞及其因子IL-17在術后1個月復查均降低，提示可能是由于垂體瘤的切除直接導致PRL分泌量的下降，PRL水平的下降負反饋的調(diào)節(jié)引起外周血Th17細胞及其因子IL-17水平的降低。因此，我們可以通過檢測外周血Th17和IL-17的水平評價PRL腺瘤的治療效果及其預后。

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(收稿2016-04-12)

Correlations of peripheral blood Th17 content and IL-17 expression with PRL level in PRL adenoma patients

MengQingjun*，MengLei，JinBaozhe，ShiHuimin，ZhouWenke

*DepartmentofNeurosurgery，theFirstPeople'sHospitalofZhengzhou，Zhengzhou450004，China

Objective To explore the relations between blood helper T lymphocyte (Th17)content as well as interleukin-17 (IL-17)expression and PRL level in PRL adenoma patients．Methods The content of Th17 in 24 PRL adenoma patients with different levels of PRL and in 16 healthy controls were detected by performing flow cytometry (FCM)and the expression of IL-17 mRNA were measured by RT-PCR technique．Finally we carried out statistical analysis．Results The content ratio of Th17 was (3.49±0.51)% in PRL patients and was (0.86±0.13)% in controls，which showed significantly statistical difference (P<0.05)；and the content increased with the increase of PRL level．The expression level of IL-17 mRNA in PRL patients before operation was (19.43±3.14)%，significantly higher than (8.91±1.92)% after operation and (2.69±0.69)% in controls (P<0.05)；and the expression increased with the increase of PRL level．Conclusion Peripheral blood Th17 content and IL-17 expression which have positive correlations with PRL level，can be regarded as indicators to evaluate clinical efficacy and prognosis．

Pituitary tumors；PRL；Th17；IL-17

R739.41

A

1673-5110(2016)24-0012-03

△通訊作者：周文科，E-mail：zhouwenke1999@163.com