經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路抑制因子NKD1在腫瘤中的表達

趙麗楠 王洪武 夏海波 王翠英 綦會霞 張俊毅 王玉敏

(赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室,內(nèi)蒙古 赤峰 024005)

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路抑制因子NKD1在腫瘤中的表達

趙麗楠 王洪武1夏海波2王翠英3綦會霞3張俊毅4王玉敏3

(赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室,內(nèi)蒙古 赤峰 024005)

NKD1;Wnt/β-catenin信號通路

裸角質(zhì)膜同源蛋白(dNKD)最早是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其基因突變是引起果蠅分節(jié)運動缺失的主要誘因〔1〕。隨后，dNKD的兩個同系物NKD1及NKD2在哺乳動物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)〔2〕，二者分別位于人染色體16q12.1和5p15.3，具有43.8%的高度同源性。NKD1的生物學(xué)作用使其可以參與經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，另外，它還是評估腫瘤患者預(yù)后的輔助指標之一。

1 NKD1 的分子特征和組織表達特異性

Wnt信號通路是體內(nèi)重要的信號通路之一，在多細胞生物體軸分化過程中承擔(dān)著非常重要的作用，還參與大腦及脊椎動物的肢體起始和頂端外胚層脊的形成，調(diào)控干細胞的生長發(fā)育。研究顯示，許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與Wnt信號通路異常表達有關(guān)〔3〕。研究〔4,5〕認為NKD1是Wnt通路的拮抗劑，廣泛表達于多種正常組織中，NKD1在胞質(zhì)中通過其EF手型結(jié)構(gòu)域(EF-Hand)與蓬亂蛋白(Dvl)的盤狀同源區(qū)域(PDZ)區(qū)域結(jié)合后，阻滯經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，并通過活化c-Jun氨基末端激酶(c-JNK)基因調(diào)控上皮細胞的極性，間接抑制腫瘤的發(fā)生。

2 NKD1與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系

研究〔6〕證實，許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展都涉及Wnt通路。Wnt信號在細胞內(nèi)有兩條通路〔7〕，即經(jīng)典Wnt/β-catenin通路和非經(jīng)典Wnt/β-catenin通路。在經(jīng)典Wnt/β-catenin通路中，配體分子Wnt 與七次跨膜受體(Fz) 和其輔助受體低密度脂蛋白相關(guān)受體(LRP)5/6結(jié)合。Wnt-Fz-LRP6復(fù)合體募集支架蛋白(Axin)和Dvl，引起LRP6磷酸化，然后將Axin聚集到受體復(fù)合體，阻止Axin介導(dǎo)的β-catenin的磷酸化，穩(wěn)定β-catenin活性，使β-catenin聚集在胞質(zhì)內(nèi)并進入細胞核，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)形成復(fù)合體，激活受Wnt通路調(diào)控的一些目標基因的表達〔8〕。當(dāng)Wnt不存在時，β-catenin會與抑癌基因(APC)、Axin、酪蛋白激酶(CK)1和糖原合成酶激酶(GSK)3 形成復(fù)合體，然后被CK1 和GSK3相繼磷酸化。磷酸化的β-catenin被E3泛素連接酶識別β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相溶蛋白(Trcp)并降解，進而TCF-LEF/Groucho和組蛋白脫乙?；?HDAC)抑制受Wnt調(diào)控的靶基因表達〔9〕。非經(jīng)典Wnt/β-catenin有兩條細胞內(nèi)途徑：①平面細胞極性通路(PCP)，在PCP通路中，F(xiàn)z與配體結(jié)合后，通過Dvl將信號傳導(dǎo)至小分子G蛋白Rac和Rho，激活下游靶基因，通過調(diào)控肌動蛋白的活性影響細胞骨架重新排列。②Wnt/Ca2+通路，Wnt信號能夠通過Dvl、Fz和G-蛋白的傳導(dǎo)，釋放細胞內(nèi)的Ca2+，Ca2+可以提高蛋白激酶(PK)C、磷酸酶(PL)C和鈣調(diào)蛋白激酶(CamK)2等酶的活性，影響細胞的生物學(xué)功能。這兩條途徑在細胞的增殖與分化、神經(jīng)發(fā)育及體軸形成等生物學(xué)過程中起至關(guān)重要的作用。Dvl是Wnt信號通路上游的一個效應(yīng)分子，是PCP通路、經(jīng)典Wnt/β-catenin通路及Wnt/Ca2+通路的重要調(diào)控因子。一些能夠與Dvl結(jié)合的蛋白可以改變Dvl的蛋白水平，這其中就有NKD1蛋白。研究表明，NKD1 對存在于細胞不同部位的β-catenin有著不同的作用，如NKD1是細胞質(zhì)中β-catenin蛋白的下游調(diào)節(jié)因子，主要維持穩(wěn)定β-catenin蛋白的水平，阻止β-catenin向胞核聚集;而細胞核內(nèi)的β-catenin，NKD1是其上游調(diào)控基因，對β-catenin的核內(nèi)累積有著負調(diào)控作用。

NKD1在細胞質(zhì)中可以通過其EF-Hand與Dvl的PDZ結(jié)構(gòu)域相結(jié)合后，作為Wnt/β-catenin通路的負調(diào)控因子發(fā)揮作用〔4,5,10,11〕，抑制Wnt/β-catenin信號通路的功能。NKD1可作為引導(dǎo)開關(guān)，使Dvl由Wnt/β-catenin通路向JNK/PCP通路轉(zhuǎn)化，進而抑制經(jīng)典通路。Wnt途徑控制脊椎動物細胞極性及細胞遷移，可被用來辨別瘤形成情況，因此Wnt途徑的抑制物NKD1同樣能夠調(diào)節(jié)腫瘤的形成和發(fā)展，具有重要意義。

3 NKD1在各種腫瘤中的表達和作用

關(guān)于 NKD1 與腫瘤的關(guān)系鮮有報道，目前的研究〔3〕證明，NKD1在胃癌、直腸腺瘤、結(jié)直腸癌及乳腺癌中的蛋白表達水平是下降的，而且它的表達水平與腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。其他研究〔6〕顯示，在肝母細胞瘤和直腸癌中NKD1的mRNA水平是上升的，奇怪的是，在非小細胞肺癌(NSCLC)中卻存在NKD1 mRNA 高表達而蛋白低表達的現(xiàn)象，且造成該蛋白低表達的原因與臨床病理因素有密切的關(guān)系。即NKD1在不同來源的腫瘤中其蛋白及mRNA的表達情況尚存在較大爭議〔12,13〕。

3.1 NKD1在結(jié)直腸癌中的表達 消化道腫瘤的發(fā)生與Wnt信號通路的異常激活有著密不可分的關(guān)系。統(tǒng)計表明，90%以上的人類結(jié)直腸癌中都存在Wnt/β-catenin信號通路的異常激活及胞內(nèi)β-catenin的累積[14，15]。因此，作為Wnt通路中最關(guān)鍵的因素之一，NKD1受到越來越多研究者們的重視。

免疫組化檢測顯示，結(jié)直腸癌患者術(shù)后癌癥組織中NKD1表達的陽性率明顯低于正常組織，NKD1的表達水平還和腫瘤的杜克(Dukes)分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及細胞增殖抗原標記物(Ki67)的表達有關(guān)，生存分析顯示若NKD1表達水平較低，則患者的預(yù)后較差。因此，結(jié)直腸癌中NKD1的表達水平對疾病的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵作用，其表達水平的高低可能對判斷患者預(yù)后會有一定的價值〔14〕。最近研究表明，NKD1 在正常組織中的陽性率明顯高于結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌，其表達水平與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔15〕。研究證明，結(jié)直腸腫瘤中β-catenin的蛋白表達水平下降是由NKD1所調(diào)控的〔5〕。Guo等〔16〕通過對NKD1缺陷的結(jié)直腸癌細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)NKD1的缺失能加強細胞中β-catenin的穩(wěn)定性且促進細胞增殖，這暗示著NKD1可能在對β-catenin的調(diào)控上發(fā)揮作用，即Wnt信號通路的負反饋調(diào)節(jié)是通過NKD1對β-catenin核聚集的負向調(diào)控來完成的。因此，NKD1可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時，聯(lián)合檢測β-catenin和NKD1的表達水平，可能為結(jié)直腸腫瘤的臨床診斷及預(yù)后評估提供一定幫助。

3.2 NKD1在肺癌中的表達 NKD1在不同來源的腫瘤中的表達尚存在較大爭議，在同一來源的腫瘤中其蛋白及mRNA的表達也存在不同情況。在NSCLC中NKD1蛋白的表達量遠遠低于癌旁肺組織，但mRNA的表達卻顯著高于癌旁肺組織，這個結(jié)果與已經(jīng)證實的在不同來源腫瘤中表達的報道相同，但同時也顯示即使在相同腫瘤中，NKD1的蛋白水平與mRNA表達水平也可能不同〔17〕。其原因可能由于NKD1蛋白表達下調(diào)，導(dǎo)致其失去了對Wnt信號通路活性的抑制作用，所以在肺癌組織中，NKD1蛋白表達水平明顯低于周邊肺組織，但其mRNA水平為什么高于周圍正常肺組織呢，有報道認為NKD1本身也是經(jīng)典Wnt信號通路的下游靶基因之一〔18〕，其mRNA表達上升，可能與肺癌組織中Wnt信號通路的高度激活狀態(tài)相關(guān)，經(jīng)典Wnt通路的高活性，可以使NKD1轉(zhuǎn)錄活性增強，導(dǎo)致mRNA出現(xiàn)高度表達狀態(tài)。然而mRNA高表達，其蛋白水平卻又明顯下降，這可能與翻譯后修飾及NKD1蛋白的降解增強有關(guān)。Yan等〔5〕則認為，在生物體內(nèi)存在著調(diào)節(jié)NKD1表達的一種負反饋機制，因此如果NKD1蛋白高表達，Wnt信號通路的活性就會受到抑制，于是NKD1的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào);然而如果NKD1蛋白表達下降，Wnt信號通路的活性就會增加，進而加快了NKD1的轉(zhuǎn)錄及翻譯，導(dǎo)致NKD1的mRNA水平上升。但目前只是推測，具體的原因和生物學(xué)機制還需要更深入的研究。趙月等〔17〕研究表明在NSCLC里，NKD1的蛋白低表達與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、高腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分期及不良預(yù)后等有密切關(guān)聯(lián)。研究表明79%的NSCLC新鮮組織標本中NKD1的蛋白表達水平顯著低于相應(yīng)的癌旁正常肺組織，而 mRNA 表達水平則顯然高于正常的肺組織。免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)顯示在 78% 的 NSCLC標本中NKD1的表達明顯低于正常肺組織〔19〕。這個發(fā)現(xiàn)雖然和已有的在不同來源腫瘤中存在表達的結(jié)果相一致，但也顯示了在同一腫瘤中，NKD1的蛋白表達與mRNA的表達水平并不完全相同。其研究結(jié)果還證實在NSCLC 中腺癌NKD1 的表達高于鱗癌，與分化程度正相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和 TNM 分期負相關(guān)，并且NKD1表達較低的患者術(shù)后生存時間明顯低于正常表達者。總之，在 NSCLC 里NKD1的蛋白表達水平是下調(diào)的，而mRNA 的表達水平卻是上調(diào)的，而且患者的臨床病理因素和不良預(yù)后都與NKD1的蛋白水平下調(diào)程度有關(guān)。肺腺癌研究顯示，40例肺腺癌中有8例NKD1的表達下調(diào)，15例NKD1正常表達，15 例NKD1高表達。而NKD1的低表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的關(guān)聯(lián)性〔20〕，所以，NKD1可作為肺腺癌預(yù)后的標志因素。

3.3 NKD1在乳腺癌中的表達 陳巍等〔21〕用免疫組化方法檢測了人乳腺癌細胞中β-catenin蛋白與NKD1的表達關(guān)系。其結(jié)果顯示，對照組中NKD1和β-catenin蛋白的表達水平顯著高于實驗組，且實驗組中NKD1和β-catenin蛋白的表達與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤的表達關(guān)系密切;實驗組中β-catenin和NKD1的表達正相關(guān)，生存分析結(jié)果顯示β-catenin和NKD1表達水平較低的患者預(yù)后較差。表明這兩種蛋白均與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)，也可以說二者在腫瘤的脈管散播過程有重要作用，Wnt/β-catenin通路可能是介導(dǎo)NKD1蛋白發(fā)揮其生物學(xué)作用的途徑?；蛘呤峭ㄟ^血管內(nèi)皮生長因子的調(diào)控發(fā)揮作用。β-catenin和NKD1之間可能存在通路作用，參與了腫瘤細胞外細胞連接的改變，協(xié)同加快腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。由于腫瘤中NKD1的異常表達導(dǎo)致Wnt/β-catenin經(jīng)典通路產(chǎn)生障礙，促使胞質(zhì)內(nèi)還沒有被磷酸化降解的β-catenin進入細胞核內(nèi)，結(jié)合TCF/LEF形成復(fù)合體，進而啟動下游相應(yīng)目標基因的轉(zhuǎn)錄，加快腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。此機制可能與癌基因的作用有關(guān)，同時也是腫瘤生長轉(zhuǎn)移過程中的生物學(xué)行為特征之一。乳腺癌中β-catenin蛋白和NKD1具有協(xié)同作用，二者的共同低表達加快了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

3.4 NKD1與骨肉瘤(OS)轉(zhuǎn)移 OS是兒童和青少年易患的疾病，是臨床上常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤之一。其惡性程度較高、血行轉(zhuǎn)移發(fā)生早、容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移、病情發(fā)展快速且死亡率特別高，因此，精確地對OS做出早期診斷和有效抑制或者阻斷OS的轉(zhuǎn)移，已經(jīng)成為治療OS的重中之重。閆康〔22〕研究發(fā)現(xiàn)，Wnt 信號通路中的NKD1 在具有高轉(zhuǎn)移性的OS細胞系 F5M2 中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，提示NKD1 可能促進OS的轉(zhuǎn)移。若改變OS細胞中miR-195 的表達水平可以相應(yīng)改變NKD1 的表達量。研究顯示，骨樣骨瘤組織和骨軟骨瘤組織中NKD1 蛋白表達陽性率顯著低于OS組織;但是骨軟骨瘤NKD1 蛋白表達陽性率與骨樣骨瘤組織 NKD1 蛋白表達的陽性率無明顯差異。同時，NKD1 的表達還與OS是否發(fā)生轉(zhuǎn)移及患者 3 年生存率顯著相關(guān)，而與年齡、性別、組織學(xué)分級、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小及組織學(xué)分型等臨床表型無明顯相關(guān)性。

綜上，腫瘤發(fā)生與NKD1表達具有重要關(guān)系，其發(fā)揮作用的途徑主要依賴于Wnt信號傳導(dǎo)通路，NKD1能抑制該通路的激活作用，抑制癌癥發(fā)生。當(dāng)NKD1表達水平下降時，Wnt信號通路被激活，引起β-catenin進入胞質(zhì)及細胞核，促進腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移。因此，NKD1對β-catenin的調(diào)控有極為重要的作用，但是對于分布在細胞不同部位的β-catenin，NKD1對其有著不同的作用。同時，NKD1還與不同腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。總之，NKD1可作為臨床上治療腫瘤的作用靶點，具有一定的臨床意義。

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〔2016-01-04修回〕

(編輯 苑云杰/王一涵)

國家自然科學(xué)基金項目(No.81260196)；國家社科基金項目(No.13CRK009);內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持計劃(No.NJYT-13-B20)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目(No.NJZZ12306，NJZZ14271)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項目(No.2014MS0892,2014BS0814，2013MS1176)

1 乳腺外科 2 泌尿外科 3 腫瘤內(nèi)科 4 病理科

王玉敏(1981-)，女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事氧化損傷與疾病研究。

趙麗楠(1988-)，女，初級檢驗師，碩士，主要從事腫瘤機制研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1786-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.095