反向遺傳操作技術(shù)在瘟病毒屬研究中的應(yīng)用

洪焜，刁乃超，李建明，時(shí)坤*，杜銳,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；3.教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，長(zhǎng)春 130118)

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反向遺傳操作技術(shù)在瘟病毒屬研究中的應(yīng)用

洪焜1，刁乃超1，李建明2，時(shí)坤2*，杜銳2,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；3.教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，長(zhǎng)春 130118)

反向遺傳操作技術(shù)已經(jīng)成為研究瘟病毒屬的一條有效的途徑。針對(duì)反向遺傳技術(shù)在瘟病毒屬基因結(jié)構(gòu)和功能研究、致病機(jī)制研究和新型疫苗研制中的應(yīng)用以及瘟病毒屬的感染性克隆策略的選擇進(jìn)行了綜述，以期為預(yù)防、控制和消滅瘟病毒屬病毒提供參考。

反向遺傳操作技術(shù)；瘟病毒屬；致病機(jī)制；應(yīng)用

瘟病毒屬(Pestivirus)屬于黃病毒科(Flaviviridae)，包括典型的豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、綿羊邊界病毒(Border disease virus，BDV)[1]、非典型的Hobi樣病毒(Hobi-like virus)[2]、Bungowannah瘟病毒(Bungowannah virus)[3]等。由CSFV和 BVDV引起的豬瘟和牛病毒性腹瀉-粘膜病給各國(guó)畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的危害和經(jīng)濟(jì)損失[4]。瘟病毒屬病毒的全基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為12.3 kb，兩端包含5′非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)和3′非編碼區(qū)(UTR)，中間是一個(gè)大的開(kāi)放性閱讀框架(open reading frame，ORF)；ORF翻譯成含約3898個(gè)氨基酸殘基、分子量約438 kD的多聚蛋白，在病毒和宿主細(xì)胞酶的作用下加工成結(jié)構(gòu)蛋白C、Erns、E1、E2和非結(jié)構(gòu)蛋白Npro、p7、NS2-3(NS2，NS3)、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B[5]。

反向遺傳學(xué)通常是在獲得生物基因信息的基礎(chǔ)上，建立一個(gè)基因組的全長(zhǎng)cDNA感染性克隆，對(duì)基因有目的地進(jìn)行定點(diǎn)突變、基因的插入/缺失和基因置換等重組操作，來(lái)研究生物基因結(jié)構(gòu)和功能的策略；其目的是研究病毒的復(fù)制，病毒蛋白的功能，病毒重組的發(fā)生率，病毒與宿主相互作用以及防治病毒策略和研發(fā)標(biāo)記疫苗等[6]。

1 反向遺傳技術(shù)在瘟病毒屬研究中的應(yīng)用

1.1 在瘟病毒屬基因組結(jié)構(gòu)和功能研究中的應(yīng)用

Moormann等通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)成功構(gòu)建了瘟病毒屬CSFV的第一個(gè)感染性cDNA克隆，同年Meyers 等成功構(gòu)建了BVDV感染性cDNA克隆，并都得到了各自的感染性病毒粒子[7-8]。Pankraz等通過(guò)對(duì)感染性BVDV cDNA克隆的3′UTR的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引入堿基的缺失，去研究基因3′UTR的功能，發(fā)現(xiàn)3′UTR調(diào)節(jié)基因的復(fù)制[9]。

Mischkale等在BVDV-2 890株全長(zhǎng)cDNA感染性克隆p890的基礎(chǔ)上通過(guò)基因缺失構(gòu)建了BVDV-2 890株C蛋白基因的缺失克隆p890△C，體外轉(zhuǎn)錄后的p890△C RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)病毒亞基因組的自主復(fù)制和病毒蛋白表達(dá)，但未獲得感染性病毒粒子；但是把p890△C RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)能穩(wěn)定表達(dá)BVDV-1蛋白C-Erns-E1-E2的互補(bǔ)細(xì)胞WT-R2，在72 h后能檢測(cè)到病毒的自主復(fù)制，在轉(zhuǎn)染后的上清和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳代中存在感染性假病毒粒子v890△C-trans，但是v890△C-trans不能在沒(méi)有互補(bǔ)的KOP-R細(xì)胞上傳代[10]。Gladue等通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)CSFV的C蛋白基因的OS9結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行替換，得到的重組CSFV在豬實(shí)驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒力的改變，但是在細(xì)胞培養(yǎng)中能顯著降低病毒復(fù)制效率[11]。

Risatti等通過(guò)反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了CSFV高致病性Brescia株和減毒疫苗CS株的嵌合體，又構(gòu)建了含BVDV NADL株E2的同源氨基酸序列的Brescia突變體去研究E2糖蛋白的毒力作用，發(fā)現(xiàn)在E2基因特定位置的氨基酸替換能導(dǎo)致CSFV毒力的部分或完全衰減[12-13]。Fahn?e等對(duì)CSFV Koslov 株全長(zhǎng)cDNA克隆的氨基酸序列重組，并在豬上實(shí)現(xiàn)病毒拯救，發(fā)現(xiàn)在Koslov株E2蛋白的兩個(gè)單一氨基酸(S763L和P968H)的變化，導(dǎo)致病毒感染豬時(shí)感染能力的衰減，在非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的單一氨基酸(D2183G)的突變能減少病毒在體外細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)[14]。

Tratschin等在CSFV Alfort/187株感染性克隆的基礎(chǔ)上用鼠泛素基因代替Npro基因，得到重組病毒vA187-Ubi，發(fā)現(xiàn)Npro對(duì)病毒的復(fù)制不是必須的[15]。Mischkale等構(gòu)建了BVDV 890株的全長(zhǎng)cDNA感染性克隆p890和缺失克隆p890△Npro，得到感染性病毒粒子v890FL和缺失Npro基因的病毒粒子v890△Npro，發(fā)現(xiàn)v890FL與親本毒株生長(zhǎng)特性相似；而v890△Npro與親本毒株相比，生長(zhǎng)速度明顯偏低，表明Npro蛋白對(duì)病毒的復(fù)制不是必須的，但能影響病毒的生長(zhǎng)[10]。陶潔構(gòu)建了BVDV SH-28株的全長(zhǎng)cDNA感染性克隆，和缺失Npro基因的亞克隆，得到感染性病毒vASH和缺失Npro基因病毒vASH△Npro，發(fā)現(xiàn)vASH△Npro的復(fù)制速度遠(yuǎn)低于vASH和親本病毒；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Npro的過(guò)量表達(dá)可顯著抑制MDBK細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白OAS、Mx1和ISGIS的表達(dá)，而缺失Npro蛋白后胞內(nèi)抗病毒蛋白OAS、Mxl和ISG15的表達(dá)量顯著增加，可能是Npro影響復(fù)制的原因[16]。

NS2蛋白對(duì)病毒RNA復(fù)制和感染性病毒產(chǎn)生是重要的。Ling L等構(gòu)建了含有海腎熒光素酶2A(Rluc2A)報(bào)告基因的CSFV嵌合cDNA克隆pA187-Rluc，并對(duì)NS2的N端的幾個(gè)代表性的保守殘留序列進(jìn)行了基因突變；發(fā)現(xiàn)在NS2的N-末端的2個(gè)天冬氨酸(NS2/D60A或NS2/D60K和NS2/D78K)的突變導(dǎo)致感染性病毒不能產(chǎn)生，并且在NS2100處的丙氨酸(NS2/R100A)被精氨酸取代后導(dǎo)致病毒滴度顯著降低。含有突變病毒基因組RNA分子(NS2/A60D、NS2/K60D和NS2/K78D)的細(xì)胞在連續(xù)傳代后，產(chǎn)生恢復(fù)突變，導(dǎo)致感染性病毒的恢復(fù)。在NS2/R100A突變體上游NS2/I90L的突變能恢復(fù)感染性病毒產(chǎn)生。揭示CSFV的NS2N-末端在調(diào)節(jié)病毒RNA中的新功能，NS2的氨基酸殘基在RNA復(fù)制水平上發(fā)生作用[17]。Risager等在大腸桿菌內(nèi)對(duì)含有CSFV全長(zhǎng)病毒cDNA的細(xì)菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome，BAC)通過(guò)進(jìn)行靶向重組修飾，添加熒光素酶(Rluc)報(bào)道序列，體外轉(zhuǎn)錄RNA并通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過(guò)熒光素酶蛋白表達(dá)的積累以及檢測(cè)胞內(nèi)的CSFV NS3蛋白產(chǎn)生去檢測(cè)RNA的翻譯和復(fù)制。發(fā)現(xiàn)復(fù)制子中包含的病毒E2編碼區(qū)對(duì)于復(fù)制效率是有利的。用來(lái)自高毒力的Koslov株或疫苗株Riems的等同序列取代來(lái)自Paderborn株的NS2和NS3編碼區(qū)的嵌合RNA，復(fù)制被阻斷[18]。

Tamura等構(gòu)建了CSFV的GPE-疫苗株與高毒力Eystrup株的NS4B嵌合病毒復(fù)制子，發(fā)現(xiàn)攜帶完整Eystrup NS4B基因嵌合低毒力GPE-衍生的病毒在豬中致病性增強(qiáng)。嵌合GPE-NS4B復(fù)制子的體外復(fù)制效率顯著高于在NS4B中僅攜帶兩個(gè)Eystrup特異性氨基酸的復(fù)制子。發(fā)現(xiàn)NS4B的N-末端結(jié)構(gòu)域可以確定細(xì)胞培養(yǎng)中的CSFV基因組復(fù)制和在豬中的病毒致病性[19]。

Sheng Chun等構(gòu)建了CSFV Shimen株全基因克隆，并在病毒cDNA相應(yīng)的NS5B、NS3、NS5A位置進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)NS5B上的依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp)活性位點(diǎn)的突變能使CSFV病毒包裝失敗，額外添加 NS5B 不能使病毒的可育性恢復(fù)，但NS5A 卻可以用反式作用因子發(fā)揮作用[20]。姬偉等通過(guò)對(duì)CSFV疫苗C株基因組NS5B分段改造后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病毒復(fù)制、包裝失敗，將NS5B從基因組缺失之后額外補(bǔ)充NS5B 同樣不能恢復(fù)病毒的可育性。可能是因?yàn)?NS5B 上有CSFV復(fù)制或組裝所需的順式作用元件，其缺失后導(dǎo)致缺失該基因的部分不能復(fù)制或正常組裝到子代病毒[21]。Risager等用來(lái)自Koslov株的RNA聚合酶編碼序列替換Paderborn 株NS5B編碼序列能大大增強(qiáng)了復(fù)制子報(bào)道蛋白的表達(dá)。相比之下，用Riem NS5B序列替換顯著降低復(fù)制子的復(fù)制效率[18]。

1.2 在瘟病毒致病機(jī)制研究中的應(yīng)用 Tamura等從豬扁桃體分離出的弱化疫苗CSFV “GPE-”株在傳11代后的GPE-/P-11病毒存在E2(T830A)、NS4B (V2475A和A2563V) 3個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，用反向遺傳學(xué)重建了這3個(gè)氨基酸突變的病毒，通過(guò)在豬的感染性實(shí)驗(yàn)證實(shí)這3個(gè)氨基酸取代是致病性下降的原因，而且E2中基因的置換影響病毒擴(kuò)散，并且NS4B的改變?cè)鰪?qiáng)了病毒RNA的復(fù)制[22]。

Wu Rd等以高毒力CSFV的Shimen株 (vSM)為主干，構(gòu)建的包含CSFV疫苗C株E2基因的嵌合病毒(CSFV) vSM/CE2，在豬的攻毒實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)毒力的致弱，但是vSM/CE2在PK15細(xì)胞中傳了幾代后毒力能被恢復(fù)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，vSM/CE2第11代的突變體vSM/CE2-p11在E2的T745I和M979K處有2個(gè)氨基酸突變。通過(guò)感染豬的試驗(yàn)表明在M979K氨基酸的置換是致病性改變的主要原因。體外研究表明，E2的T745I和M979K能增加感染性病毒的復(fù)制和產(chǎn)生。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，位于E2蛋白的745和979位置的2個(gè)氨基酸殘基對(duì)嵌合病毒(CSFV)vSM/CE2體外的復(fù)制和體內(nèi)的致病性改變是重要的[23]。

Velazquez-Salinas等通過(guò)基因突變構(gòu)建了CSFV強(qiáng)毒株Brescia(BICv)株E2基因的4個(gè)不同的突變克隆(pCSFm1～pCSFm4)，但只有三個(gè)克隆產(chǎn)生了感染性病毒粒子(CSFm2v、CSFm3v和CSFm4v)。豬感染CSFm2v后呈現(xiàn)病毒血癥減少和擴(kuò)散，但沒(méi)有顯現(xiàn)出任何與豬瘟(CSF)相關(guān)的臨床癥狀，原因是在感染豬后，CSFm2v復(fù)制能力與親本BICv相比嚴(yán)重下降。動(dòng)物感染CSFm2v后檢測(cè)到動(dòng)物感有病毒血癥的減少和擴(kuò)散，但沒(méi)有顯示任何豬瘟(CSF)相關(guān)的臨床癥狀，并能耐受親本病毒BICv的攻毒[24]。

Tamura等通過(guò)活減毒CSF疫苗株GPE-的全長(zhǎng)cDNA感染性克隆體外拯救了多個(gè)含有Npro突變和缺失Npro的病毒，并接種豬，發(fā)現(xiàn)攜帶在Npro的N136D取代的病毒恢復(fù)了降解IRF3和體外抑制IFN-α/β誘導(dǎo)的能力。并且在豬中，Npro顯著降低淋巴器官中的局部IFN-α mRNA表達(dá)，同時(shí)增加循環(huán)中IFN-α/β的量，并增強(qiáng)中等毒性病毒的致病性。缺失Npro可以減少毒性和誘導(dǎo)免疫無(wú)特定病原體(SPF)的豬[25]。Lamp B等將以CSFV p447株為模板的NS3突變序列插入到cp CSFV復(fù)制子克隆 p447rep中，得到NS3編碼區(qū)突變的病毒，發(fā)現(xiàn)NS3的編碼區(qū)是瘟病毒屬基因組復(fù)制和編碼的一個(gè)關(guān)鍵組件；NS3編碼區(qū)突變，并不直接影響病毒基因組的復(fù)制速度[26]。Fahn?e等在研究CSFV高毒力的Koslov株時(shí)，從感染Koslov株的豬血液中提取RNA，得到非功能性的cDNAs，通過(guò)逐步定點(diǎn)突變，消除非同義突變,得到了與CSFV高毒力株Koslov全部功能性一致的CSFV的cDNA。通過(guò)感染豬的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)功能cDNA重組得到的病毒在強(qiáng)毒力上與親本病毒(Koslov株)一致，伴隨著感染動(dòng)物出現(xiàn)明顯的臨床癥狀并導(dǎo)致高的死亡率，證明了幾個(gè)氨基酸的改變能有效改變病毒的功能，在自然宿主動(dòng)物上降低病毒的毒力[14]。

1.3 在新型疫苗研制中的應(yīng)用 反向遺傳操作技術(shù)已經(jīng)成為研究新型疫苗的實(shí)用的工具，如研發(fā)標(biāo)記疫苗，減毒疫苗，嵌合疫苗等。Holinka LG等構(gòu)建了CSFV的FlagT4v 株的雙抗標(biāo)記疫苗，在FlagT4v的E1處插入19mer，作為陽(yáng)性標(biāo)記，并在E2處引入單克隆抗體WH303(mAbWH303)表位的結(jié)合位點(diǎn)作為陰性標(biāo)記，用于區(qū)分天然感染的和接種的豬，突變FlagT4v在接種豬后的早期(2 d或3 d)和后期(28 d)的豬能CSFV Brescia株感染，F(xiàn)lagT4V在豬中誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)對(duì)Flag?表位強(qiáng)烈反應(yīng)，但不能抑制mAbWH303與代表WH303表位的合成肽的結(jié)合[27]。付強(qiáng)等通過(guò)構(gòu)建具有T7 RNA聚合酶活性和較好穩(wěn)定性的MDBK-T7RNAP細(xì)胞，構(gòu)建了BVDV NADL毒株的E2和NS4B定點(diǎn)突變株BVDV E2M和NS4BM；與親本NADL株相比，BVDV E2M和NS4BM mRNA的復(fù)制水平能力和增殖能力有所下降；并且得到的BVDV點(diǎn)突變株 E2M和NS4BM具有好的遺傳穩(wěn)定性[28]。

Li Yongfeng等以高毒性CSFV石門株的遺傳背景構(gòu)建了含有EGFP標(biāo)簽和自疫苗株HCLV(C株)3′UTR的標(biāo)記嵌合病毒。標(biāo)記嵌合病毒與僅有EGFP標(biāo)簽的重組CSFV病毒或親本病毒相比，有低約100倍的病毒滴度，更低的病毒基因組復(fù)制水平和更弱的熒光強(qiáng)度。并且標(biāo)記嵌合體在接種的豬后沒(méi)有顯示病毒血癥，接種15 d后能免于致死性CSFV攻擊[29]。

高飛等在高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)細(xì)胞致弱疫苗株HUN4-F112的全長(zhǎng)感染性克隆上，插入CSFV疫苗株C株的E2基因，得到能表達(dá)豬瘟C株E2蛋白的重組PRRSV vA-C-E2。重組病毒vA-C-E2傳代過(guò)程中至少在20代保持遺傳穩(wěn)定；且發(fā)現(xiàn)此突變病毒與親本病毒vHuN4-F112在病毒滴度、空斑形態(tài)、蛋白表達(dá)等方面差異不顯著；在病毒的峰滴度和病毒增殖趨勢(shì)上相似[30]。董超等在CSFV疫苗C株和強(qiáng)毒石門株感染性克隆的基礎(chǔ)上，對(duì)兩個(gè)毒株不同蛋白區(qū)段進(jìn)行相互置換，構(gòu)建了一系列重組嵌合病毒，發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-NS4B區(qū)以及NS2跨膜區(qū)域?qū)ωi瘟病毒的增殖是重要的，在疫苗C株基因組兩端的UTR以及結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域能夠介導(dǎo)兔體發(fā)熱反應(yīng)[31]。

2 感染性克隆策略的選擇

目前，國(guó)內(nèi)外構(gòu)建感染性克隆構(gòu)建方法，主要有典型的細(xì)菌質(zhì)粒載體重組策略、基于細(xì)菌人工染色體(BAC)重組策略和酵母菌的重組策略。由于瘟病毒屬的基因組對(duì)大腸桿菌質(zhì)粒載體具有毒性，存在不穩(wěn)定性，所以典型的瘟病毒屬全長(zhǎng)cDNA克隆大都需在細(xì)菌低拷貝質(zhì)粒載體中構(gòu)建，但是重組克隆質(zhì)粒在大腸桿菌傳代過(guò)程中也存在不穩(wěn)定性。

2.1 基于細(xì)菌人工染色載體的克隆 BAC載體已經(jīng)被用于多種病毒全基因感染性克隆的構(gòu)建，如人巨細(xì)胞病毒(HCMV)等[32]。Rasmussen等通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增與參考毒株基因一致的全長(zhǎng)CDNA復(fù)制子，插入到單拷貝的BAC載體pBeloBAC11的策略，構(gòu)建了4個(gè)病毒(BVDV-CP7、BDV-Gifhorn、CSFV-C、CSFV-Paderborn)的全長(zhǎng)cDNA克隆[33]。Risager PC等通過(guò)BAC構(gòu)建CSFV的復(fù)制子去分析影響病毒RNA復(fù)制的因素[19]。Kamboj等通過(guò)over-lap PCR和重組技術(shù)在BAC載體構(gòu)建了CSFV野生分離株感染性cDNA克隆，通過(guò)使用CSFV特異多克隆血清的FAT實(shí)驗(yàn)和RT-PCR對(duì)拯救出的vCSFV與親本CSFV進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的特性相似[34]。

2.2 基于酵母同源重組的克隆 酵母菌同源重組的方法已經(jīng)應(yīng)用在多種病毒的cDNA克隆的構(gòu)建，如登革熱病毒[35]。與其他重組DNA技術(shù)相比，酵母菌同源重組克隆是一個(gè)有效率的和節(jié)約成本的方法，酵母菌同源重組中，需DNA片段末端含有與載體末端同源的序列，兩者在宿主細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)同源重組能直接克隆[36]。Arenhart等通過(guò)酵母同源重組在非致細(xì)胞病變型 BVDV的Npro和C蛋白編碼區(qū)插入Gluc報(bào)告基因，構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA克隆，得到能表達(dá)Gluc報(bào)告基因且能復(fù)制的病毒，拯救病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中能穩(wěn)定傳15代以上，與母本的病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)，大小，形態(tài)學(xué)保持相似性；通過(guò)Gluc活性檢測(cè)證明了報(bào)告蛋白能正確表達(dá)，表明基因增加了555 bp后在酵母菌重組中能被簡(jiǎn)單組裝并且cDNA克隆能穩(wěn)定表達(dá)[37]。Arenhart等又通過(guò)酵母同源重組技術(shù)把BVDV NADL株的兩端的UTRs和巴西BVDV IBSP4ncp株的ORF的連接起來(lái)，成功得到BVDV的嵌合cDNA感染性克隆，通過(guò)病毒拯救，得到了能擴(kuò)增的病毒IBSP4ncp，病毒IBSP4ncp在復(fù)制動(dòng)力學(xué)、大小和形態(tài)學(xué)上與親本病毒具有相似性。而且病毒IBSP4ncp能夠在細(xì)胞培養(yǎng)中能夠穩(wěn)定傳10代，并且在細(xì)胞中能維持其復(fù)制能力不被改變[38]。

3 展 望

隨著反向遺傳操作技術(shù)在基因組操作中的出現(xiàn)，推進(jìn)了瘟病毒屬病毒研究的發(fā)展。我們就反向遺傳技術(shù)在過(guò)去和當(dāng)前在瘟病毒屬的研究和應(yīng)用展開(kāi)描述，雖然對(duì)病毒的復(fù)制和翻譯的研究已經(jīng)有很多，但是病毒蛋白質(zhì)的機(jī)制研究仍處于起步階段。反向遺傳技術(shù)可能為瘟病屬的急需解決的問(wèn)題如疾病防治、致病機(jī)制、持續(xù)性感染機(jī)制、疫苗研究等提供一個(gè)實(shí)用的工具。我們認(rèn)為關(guān)鍵的是通過(guò)該技術(shù)推進(jìn)瘟病屬的病毒毒力、病毒種群適應(yīng)性、病毒致病機(jī)制，病毒疫苗方面的研究。通過(guò)整合反向遺傳技術(shù)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)新穎的宿主細(xì)胞等方法的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)下一代疫苗的開(kāi)發(fā)、應(yīng)對(duì)未來(lái)瘟病毒屬乃至其他黃病毒科的病毒爆發(fā)是至關(guān)重要的。

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(編輯：李文平)

Application of Reverse Genetics Technology inPestivirusResearch

HONG Kun1, DIAO Nai-chao1, LI Jian-ming2, SHI Kun2*, DU Rui2,3*

(1.CollegeofAnimalScience&Technology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.CollegeofChineseMedicineMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 3.KeyLaboratoryofAnimalProduction,ProductQualityandSecurity,MinistryofEducationofthePeople’sRepublicofChina,LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince,Changchun130118,China)

SHIKun,E-mail:sk1981521@126.com;DURui,E-mail:104974602@qq.com

In this paper, the application of reverse genetics in the study of the structure and function, the pathogenic mechanisms, the novel vaccines ofPestivirus, and the selection of infectious cloning strategies ofPestivirushas reviewed in order to provide reference for the prevention, control and eradication ofPestivirus.

reverse genetics technology;Pestivirus; pathogenesis; application

國(guó)家自然科學(xué)基金(31372436)；吉林省科技廳產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟項(xiàng)目(2014030918YY)；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)啟動(dòng)基金(201425) 作者簡(jiǎn)介： 洪焜，男，碩士研究生，從事經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病研究。

時(shí)坤，E-mail: sk1981521@126.com；杜銳，E-mail: 104974602@qq.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.11

2017-01-17

A

1002-1280 (2017) 07-0057-07

S852.65