黃小潔，陳曉春，劉丹，朱真，侯力丹，李慧姣，李俊平，楊承槐

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

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SPF雞感染網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒后血清和卵黃的抗體反應相關(guān)性比較

黃小潔，陳曉春，劉丹，朱真，侯力丹，李慧姣，李俊平*，楊承槐*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

為進一步研究采用卵黃抗體檢測代替血清抗體檢測的可行性，采用已建立的卵黃抗體ELISA檢測方法，比較同一時期卵黃抗體與血清抗體的相關(guān)性。人工感染23周齡無特定病原體(SPF)雞，每周采集全血分離血清，每天收集種蛋，ELISA方法檢測血清、種蛋中的REV抗體，并進行比較，結(jié)果表明：攻毒后第2周開始血清抗體和卵黃抗體呈陽性，并達到峰值，之后抗體水平緩慢下降，兩者具有相似的消長規(guī)律；對同一時期的卵黃抗體和血清抗體S/P比值進行統(tǒng)計學比較，P值小于0.05，相關(guān)系數(shù)為0.931，表明兩者差異性不顯著，相關(guān)性很好；陰陽性符合率比較，陽性符合率為97.8%，陰性符合率為100%，總體符合率為98.4%，陰陽性復合率很高。試驗證明，同一時期的卵黃抗體和血清抗體的相關(guān)性很好，可用卵黃抗體檢測方法代替血清抗體檢測，從而為監(jiān)測SPF雞群感染REV提供新的技術(shù)手段。

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒；血清；卵黃；抗體；ELISA；相關(guān)性

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(Reticuloendotheliosis，RE)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)群引起的幾種禽類的一群病理綜合征。RE 是迄今繼雞白血病(AL)、雞馬立克氏病(MD)之后發(fā)現(xiàn)的第3種具有傳染性的病毒性腫瘤病。REV不僅能夠通過接觸水平傳播，還能通過雞胚垂直傳播[1]。

在國標規(guī)定的19種SPF雞監(jiān)測的微生物中，疫苗生產(chǎn)企業(yè)主要關(guān)注ALV、REV、REO等六種蛋傳病毒的影響。國標規(guī)定，REV的檢測方法是瓊脂擴散方法(AGP)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法[2]。AGP的敏感性較低、且需要大量的純化抗原，因而目前使用較多的是血清抗體ELISA方法，并且市場上已有很多商品化的ELISA檢測試劑盒可供選擇。ELISA方法需要采集血清，而血清采集費時費力，且易引起雞的應激反應，導致雞生產(chǎn)性能下降，并且疫苗生產(chǎn)企業(yè)在檢驗血清的獲取上也存在很多困難。針對上述問題，本研究采用已建立的卵黃抗體ELISA檢測方法[3]比較了SPF雞中卵黃抗體與血清抗體的相關(guān)性，為下一步運用卵黃抗體檢測代替血清抗體檢測，監(jiān)測SPF雞群REV的感染情況提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 5只16周齡SPF雞，購自北京梅里亞維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，分成兩組，4只為攻毒組，1只為對照組，分別飼養(yǎng)于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所SPF禽隔離器內(nèi)。

1.1.2 病毒 REV MD-2株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測室分離保存。

1.1.3 試劑 REV ELISA抗體試劑盒,購自IDEXX公司。吐溫-20購自國藥集團。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗 SPF蛋雞在20周齡陸續(xù)開產(chǎn)，23周齡時產(chǎn)蛋情況穩(wěn)定，血清REV抗體檢測為陰性。攻毒組按每只雞5×104TCID50注射REV MD-2株強毒，對照組注射同等劑量的生理鹽水。每周采全血分離血清，每天收集種蛋。

1.2.2 血清抗體ELISA檢測 方法按抗體檢測試劑盒說明書進行。

1.2.3 卵黃抗體ELISA檢測 按照已優(yōu)化的卵黃抗體處理方法[3]直接提取卵黃抗體，并稀釋至300倍，用含0.05%吐溫-20蒸餾水洗滌，其他操作按ELISA試劑盒的說明進行。

1.2.4 相關(guān)性比較 將卵黃抗體檢測和血清抗 體檢測的OD值分別按試劑盒說明書要求的方法換算成S/P比值，比較兩者相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 樣品收集結(jié)果 本次實驗抗體監(jiān)測持續(xù)10周，每周采集一次血清，每天收集雞蛋。5只雞共采血清樣品50份，卵黃樣品64份。其中，攻毒組采集血清樣品40份，卵黃樣品49份；對照組采集血清樣品10份，卵黃樣品15份。

2.2 SPF雞接種REV強毒后血清抗體反應動態(tài) 攻毒組在23周齡攻毒，攻毒后第1周血清中REV抗體陰性，第2周開始產(chǎn)生抗體，并達到峰值，之后抗體水平呈緩慢下降的趨勢(圖1)。而陰性對照組血清抗體的S/P比值均小于0.5，檢測結(jié)果為陰性，表明對照雞沒有受REV感染。

圖1 SPF雞血清抗體反應動態(tài)Fig 1 Response dynamics of SPF chickens serum antibody response

2.3 SPF雞接種REV強毒后卵黃抗體反應動態(tài) 攻毒組共收集雞蛋樣品40份，對照組樣品15份。同血清抗體相似，感染后第1周卵黃REV抗體陰性(圖2)，第2周開始REV抗體呈陽性，且達到峰值，之后抗體水平呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。對照組的卵黃抗體S/P比值均低于0.5，同血清抗體檢測結(jié)果一致。

圖2 SPF雞卵黃抗體反應動態(tài)Fig 2 Response dynamics of SPF chickens yolk antibody

2.4 血清抗體與卵黃抗體檢測結(jié)果比較 運用SPSS13.0軟件進行分析，同一時期的血清和卵黃抗體檢測結(jié)果差異不顯著(P>0.05)，卵黃抗體和血清抗體的S/P比值相關(guān)系數(shù)為0.931(圖3)，表明卵黃抗體和血清抗體的S/P比值相關(guān)性很好。

圖3 同一時期的卵黃抗體和血清抗體相關(guān)性分析Fig 3 Comparision of relationship between yolk and serum antibody in the same time

2.5 SPF雞卵黃抗體與血清抗體的吻合率比較 攻毒后第1周所有卵黃、血清均為REV抗體陰性，第2周以后所有血清樣品均為陽性，卵黃樣品有1份為陰性，其他24份為陽性(表1)。卵黃與血清的陽性符合率為44/(44+1)=97.8%，陰性符合率為19/19=100%，總體符合率為63/(63+1)=98.4%。

3 討 論

REV是禽類重要的致瘤性和免疫性抑制病之一，是威脅養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的一種重要蛋傳疾病。并且由于該病的垂直傳播性，如若生產(chǎn)弱毒疫苗的一批雞胚中有個別污染了REV，就會使整批疫苗污染病毒，導致給出殼雛雞接種時，人為造成全群感染，導致污染外源病毒的疫苗報廢和發(fā)病雞群的淘汰，造成巨大的經(jīng)濟損失，引發(fā)各種糾紛。因此，SPF蛋的質(zhì)量尤其重要，但生產(chǎn)上都是采用檢測SPF雞血清的抗體水平。

本研究運用已建立的卵黃抗體ELISA檢測方法，對人工感染的SPF蛋雞的血清和卵黃進行抗體檢測。結(jié)果顯示，感染后卵黃和血清抗體在同一時間段產(chǎn)生，即都在攻毒后的第二周產(chǎn)生，并達到峰值。Vicco V Bülow[4]在1977年的實驗中證明21日齡的小雞接種REV強毒后在21日齡時產(chǎn)生抗體，并達到峰值。這個差異很可能與REV病毒的特性有關(guān)系，該病毒主要感染小日齡雞，雞齡越大免疫機能越完善，大日齡的雞比小日齡的雞在接種后能更快產(chǎn)生抗體。之后抗體隨著周齡的增加基本處于緩慢下降趨勢，該結(jié)果與Bagust T J[5]在1979年、Bulow V V[6]在1977年的實驗結(jié)果一致，REV抗體隨著雞年齡的增加而降低。本實驗結(jié)果表明，卵黃抗體與血清抗體兩者具有相似的消長規(guī)律。卵黃抗體的S/P比值要稍高于血清抗體的值，原因可能是卵黃對抗體具有聚集作用而引起的。卵黃抗體與血清抗體S/P比值的統(tǒng)計學差異不顯著，相關(guān)性良好，并且卵黃抗體與血清抗體陽性符合率為97.5%，陰性吻合率為100%，表明卵黃抗體檢測確實能夠反應血清抗體的水平，可用此方法判斷雞群是否感染過該病毒。采用卵黃進行抗體檢測不僅能避免雞群采血應激帶來的經(jīng)濟損失，而且節(jié)省人力物力，是一種有效、易行、適合推廣的監(jiān)測雞群質(zhì)量狀況的檢測方法。值得注意的是，卵黃和血清一樣，抗體的產(chǎn)生相比雞群的感染是要滯后兩周以上，因此不能篩查雞群的早期感染，具有一定的滯后性。

表1 SPF雞卵黃抗體與血清抗體的符合率比較Tab 1 Comparision of the coincidence rate between egg yolk antibody and serum antibody of SPF chickens

[1] Y M Saif.禽病學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2012:663-688.

Y M Saif. Diseases of poultry[M]. Beijing:China Agriculture Press, 2012:663-688.

[2] 全國動物防疫標準化技術(shù)委員會. GB/T 17999-2008 SPF雞微生物學監(jiān)測 [M].北京：中國標準出版社.

Nationgal Technical Standardization Committee of Animal Epidemic Prevention. GB/T 17999-2008 Microbiological monitoring of SPF chickens[M]. Beijing: China Standard Press.

[3] 黃小潔，姚文生，楊承槐，等.ELISA法檢測種蛋卵黃中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒抗體的研究[J].中國獸藥雜志，2016，50(2)：7-11.

Huang X J, Yao W S, Yang C H,etal. Study on the ELISA detection for avian reticuloendotheliosis virus antibody in egg yolk[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2016, 50 (2):7-11.

[4] Vicco V Bülow. Immunological effects of reticuloendotheliosis virus as potential contaminant of Marek's disease vaccines[J]. Avian Pathology, 1977, 6: 4, 383-393.

[5] Bagust T J and Grimes T M. Experimental infection of chickens with an Australian strain of reticuloendotheliosis virus. 2.serological responses and pathogenesis[J]. Avian Pathology, 1979, 8:375-389.

[6] Bulow V V. Immunological effects of reticuloendotheliosis virus as potential contaminant of Marek's disease vaccines[J]. Avian Pathology, 1977, 12:179-198.

(編輯：李文平)

Study on the Relationship between Yolk Antibody and Serum Antibody in SPF Chickens Infected with Reticuloendotheliosis Virus

HUANG Xiao-jie, CHEN Xiao-chun, LIU Dan, ZHU Zhen, HOU Li-dan, LI Hui-jiao, LI Jun-ping*, YANG Cheng-huai*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

LiJun-ping,E-mail:lijunping@ivdc.org.cn；YangCheng-huai,E-mail:yangchenghuai@ivdc.org.cn

In order to study the feasibility of using yolk antibody test instead of serum antibody test, the correlation of the yolk and serum antibody in the same period was compared using the established method of ELISA detection of yolk antibody. 23-week old SPF chickens were infected, blood samples were collected and serum was isolated every week, eggs were collected every day, correlation between yolk antibody and serum antibody were compared after test using ELISA. The result showed that the serum antibody and yolk antibody could be tested from the second week after infected and reached the highest level. After that the antibody decreased slowly, so the yolk antibody had the similar disciplinarian with the serum antibody. S/P ratio of the yolk and the serum antibody in the same period was compared by statistical method, P was less than 0.05 and the correlation coefficient was 0.931, which indicated that the difference was not significant and the correlation was very good. The positive coincidence rate was 97.5%, the negative coincidence rate was 100%, the overall coincidence rate was 98.4%, the coincidence rate of the positive and the negative was high. Experiment proved the correlation between yolk and serum antibody in the same time was very good, using yolk antibody detection instead of serum antibody was feasible, which could be used to monitor REV of SPF chickens.

REV; serum; yolk; antibody; ELISA; correlation

黃小潔，獸醫(yī)碩士，從事原材料質(zhì)量控制工作。

李俊平，E-mail: lijunping@ivdc.org.cn；楊承槐，E-mail: yangchenghuai@ivdc.org.cn

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.02

2017-02-17

A

1002-1280 (2017) 07-0006-04

S852.5