布魯氏菌S19疫苗應(yīng)用及研究進展

葉俊賢，馮宇，陳瑞愛，丁家波*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

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布魯氏菌S19疫苗應(yīng)用及研究進展

葉俊賢1,2，馮宇1，陳瑞愛2*，丁家波1*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌引起的一種重要的人獸共患病，該病對畜牧業(yè)和人類健康均構(gòu)成嚴重威脅，使用疫苗免疫是防控布病的重要措施之一。光滑型牛種布魯氏菌19(S19)活疫苗是世界上第一個被廣泛應(yīng)用且效果良好的布病疫苗，至今為止仍是使用最廣泛的疫苗之一。本文主要從應(yīng)用情況及目前研究進展兩大方面對S19疫苗進行概述，以期為日后使用該疫苗預(yù)防布魯氏菌病提供借鑒及為疫苗研究提供思路。

布魯氏菌；布魯氏菌??；S19疫苗

布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)感染機體而引起的人獸共患傳染病。布魯氏菌是革蘭氏陰性、兼性胞內(nèi)寄生菌，根據(jù)宿主特異性、生化特性和抗原組成目前大致分為10個生物種，包含20個生物分型，其中常見且危害性較大的是羊種、牛種和豬種[1]。布魯氏菌可感染多種野生動物和家畜，主要侵害機體淋巴系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，感染后能夠?qū)е履感蟛辉胁挥?、早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降等；公畜則出現(xiàn)睪丸炎、機體消瘦等癥狀[2]。人類可以通過接觸受感染動物及受污染物品而感染。人感染布魯氏菌后，表現(xiàn)出波浪熱、多汗、全身乏力、關(guān)節(jié)疼痛甚至變形、睪丸腫大、神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)功能障礙等，病情較長且反復(fù)，給病人帶來極大痛苦和傷害[3]。該病一方面給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，另一方面對人類健康和社會公共衛(wèi)生安全有極大的隱患。因此，在布病流行的國家，布病防控及消除工作一直是公共健康計劃的重要內(nèi)容。另外，據(jù)統(tǒng)計，我國動物布病發(fā)病率在2005-2007年基本保持穩(wěn)定，但2008年以后發(fā)病率開始大幅上升，2009年的發(fā)病數(shù)已達到2000年的18.6倍[4]，2011年全國報告的新發(fā)病例數(shù)比2010年增加了28.8%[5]。數(shù)據(jù)顯示目前我國布病疫情形勢相當嚴峻，有效防控布病刻不容緩。

帶菌的動物是引起布病發(fā)生的主要傳染源。因此，加強動物布病的防控勢在必行，這對防控人間布病同樣具有重要的意義。在正確診斷和捕殺患病動物、有效切斷傳播途徑的基礎(chǔ)上，接種疫苗是公認的能夠降低動物布病發(fā)生和傳播的最實際有效的方法之一。牛種布魯氏菌19 (B.abortusstrain19，S19)疫苗是世界上第一個被廣泛使用的有效預(yù)防布病的動物疫苗[6]。20世紀50年代，我國從前蘇聯(lián)引進S19疫苗株[7]，用于養(yǎng)殖業(yè)中布魯氏菌的防治，迄今為止在我國已使用60多年，該疫苗株為我國有效地防控牛布病做出了卓越貢獻。本文將對S19疫苗的應(yīng)用及研究進展進行概述。

1 疫苗概況

S19疫苗株是光滑型牛種布魯氏菌弱毒活菌株，最初的S19疫苗株是John Buck在1923年從新澤西奶牛場的牛奶樣品中分離，并在實驗室條件下，傳代培養(yǎng)一年后得到的弱毒光滑型突變株。由于早期該疫苗使用過程中發(fā)現(xiàn)能導(dǎo)致部分懷孕母畜流產(chǎn)以及人的感染，安全性較低，在美國被禁止使用。目前廣泛使用的S19疫苗株是1956年由美國科學(xué)家篩選得到的對赤蘚醇ery基因敏感的缺失株，安全性較初期疫苗有所提高[8]。

S19疫苗于20世紀30年代起便在世界范圍內(nèi)被用于預(yù)防牛布魯氏菌病。在美國，該疫苗一直到20世紀90年代中期，才逐漸被粗糙型RB51疫苗代替。S19疫苗目前仍是OIE認可的布病參考疫苗，是印度、阿根廷、巴西等許多國家的布病參考疫苗[9]。自2001起，巴西為了降低國內(nèi)布魯氏菌病患病率和感染率，已開始實施對雌性犢牛實行強制免疫S19疫苗[10]。在蘇丹等非洲國家，S19疫苗株仍然是布病防控使用的主要疫苗[11]?？梢?，S19疫苗在世界防控布魯氏菌病工作中被廣泛使用，且一直發(fā)揮巨大作用。

在我國，A19(S19株在《中國獸藥典》中被稱為A19株)疫苗已經(jīng)使用了60多年，在相當長的一段時間里，對布魯氏菌防控起到至關(guān)重要作用。丁家波等[12]曾對我國保存的不同時期、不同國家來源S19菌株進行過鑒定，均未檢測到ery基因的缺失。由此推測可能由于歷史的原因，我國當時未引進ery基因缺失的S19株，目前實際使用的A19株應(yīng)該是1956年前被廣泛使用的S19疫苗株。

2 疫苗的應(yīng)用

2.1 疫苗臨床效果 國外，美國國家動物疫病實驗室關(guān)于S19疫苗的總結(jié)報告指出，65%～75%免疫動物不被感染，25%～35%免疫動物雖然感染，但沒有流產(chǎn)等明顯臨床癥狀[13]。國內(nèi)，河北蘆臺應(yīng)用該苗，能有效防控因布魯氏菌引起的流產(chǎn)；對內(nèi)蒙古的黃牛群接種免疫A19后，布魯氏菌檢出率由免疫前的86.7%降低到免疫后的29.4%；在青海對母牦牛后免疫，流產(chǎn)率由免疫前的28.48%降低下降為1.26%；在新疆的5個奶牛養(yǎng)殖小區(qū)聯(lián)合使用S2和A19疫苗，經(jīng)過連續(xù)2年防控監(jiān)測，各個養(yǎng)殖小區(qū)能繁母牛流產(chǎn)率明顯下降，流產(chǎn)率最高的小區(qū)從超過10%下降至1%以下[14]。

S19(A19)疫苗的臨床效果明顯，能有效防控布魯氏菌感染，降低畜群死胎率和流產(chǎn)率，為畜群健康保健護航，同時還減少因能繁母牛死胎、流產(chǎn)所導(dǎo)致的經(jīng)濟損失。

2.2 疫苗效果的影響因素 S19疫苗的免疫保護效力與免疫劑量、免疫途徑、動物年齡、動物群體免疫情況等因素有相關(guān)。

使用不同免疫劑量，S19疫苗能對動物提供不同程度的流產(chǎn)保護力[15]。國外使用強毒2308株攻毒試驗研究表明，疫苗有效注射量越高，其保護效果越好；使用低劑量多次免疫，也能得到較好的保護力。臨床應(yīng)用中，應(yīng)注意根據(jù)免疫動物的實際情況，選用合適的免疫劑量。

免疫途徑也是影響疫苗效果的重要因素之一。以我國A19疫苗臨床使用為例，接種對象為育成牛和產(chǎn)后母牛，不能在懷孕牛上使用。懷孕母牛皮下注射免疫劑量S19疫苗，能夠引起約3.2%的流產(chǎn)率；當給孕牛靜脈注射相同劑量時，流產(chǎn)率可達100%[16]。犢牛3～8月齡時進行第一次皮下注射接種，18～20月齡(第1次配種前)進行第二次免疫接種，疫苗產(chǎn)生的免疫有效保護期為72個月。一般不免疫3月齡以下犢牛，因為一是免疫系統(tǒng)不健全，二是犢牛對布魯氏菌感染不敏感。該疫苗免疫公畜時，能導(dǎo)致睪丸炎的發(fā)生。正確的免疫途徑，能更好的發(fā)揮疫苗的效果，同時能避免不必要的意外和損失。

布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，如果在牛只疫苗接種前已經(jīng)感染，即使接種疫苗，抗體持續(xù)陽性，但機體一旦免疫機能降低，布魯氏菌仍能從細胞內(nèi)釋放進入體液循環(huán)，引起機體啟動記憶反應(yīng)，發(fā)揮細胞和體液免疫，將體液中的病原菌清除，這一過程伴隨著動物的發(fā)熱等體征，隨后退熱，牛只看似恢復(fù)，但在細胞內(nèi)的病原菌并不能清除，導(dǎo)致機體反復(fù)發(fā)熱，對牛群構(gòu)成潛在的風險。因此，在免疫接種前必須保證牛只的健康，要對牛群進行檢疫，血清學(xué)陽性或出現(xiàn)發(fā)熱、流產(chǎn)等臨床指標陽性的可疑奶牛，必須隔離，只接種健康牛群，否則會造成牛群長期隱性帶菌。

2.3 疫苗缺點 在長期臨床使用過程，人們也發(fā)現(xiàn)S19疫苗有其局限性。如S19疫苗可以對免疫牛群產(chǎn)生較好的保護性，但對山羊免疫效果不太理想，對豬免疫則完全無效。S19疫苗是中等毒力疫苗，接種后可引起明顯局部反應(yīng)、能導(dǎo)致孕畜流產(chǎn)、公畜睪丸炎等情況，大劑量接觸疫苗細菌時，甚至能引起人感染。所以在臨床使用時，一方面要注意疫苗的使用方法和免疫對象，另一方面，使用者必須做好自身防護，同時也要注意消毒，防止疫苗在環(huán)境擴散。

另外，S19疫苗是光滑型布魯氏菌，其LPS含有O-側(cè)鏈，使用血清學(xué)方法檢測感染動物時，不能區(qū)分動物是自然感染還是疫苗接種，這給布魯氏菌病的流行病學(xué)調(diào)查，對疫源地的掌控和疾病凈化工作帶來了阻礙。

3 疫苗研究

3.1 毒力評價 國際上通常有3種方法反映布魯氏菌的毒力：對豚鼠的最小感染量、感染豚鼠的脾臟含菌量以及感染小鼠體內(nèi)的存活時間，其中對豚鼠的最小感染量通常用于對強毒株布魯氏菌毒力的測定。程君生等[17]使用小鼠體內(nèi)存活時間和豚鼠脾含菌量兩種方法，對我國現(xiàn)有的3種布病疫苗(A19、M5、S2)的毒力進行了測定和分析，證明A19毒力介于S2和M5之間，且毒力穩(wěn)定不返強。同時，A19疫苗感染的豚鼠每克脾臟含菌量最高不超過20萬，符合我國《獸用生物制品規(guī)程》中對布病疫苗種毒的毒力規(guī)定，認為是可安全使用的臨床弱毒活疫苗。持續(xù)的定殖力可長時間飼養(yǎng)的畜群，如奶牛、種畜等提供持久的保護力。

在分子水平上，鑒于我國A19株較目前國際流行使用的S19株仍ery基因序列，與前期S19疫苗株一致，故認為毒力高于國際S19疫苗株。但研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌強毒株也存在ery基因序列缺失的情況，卻并不會像S19一樣毒力致弱，所以研究人員認為赤蘚醇代謝受影響并不是導(dǎo)致S19毒力致弱的主要原因。對牛種布魯氏菌強毒株和S19疫苗株進行了全基因組測序和比較基因組學(xué)分析，鑒定了新的可能導(dǎo)致S19疫苗株毒力致弱的基因，對這些基因的進一步功能驗證有助于闡明S19的毒力機制[18]。

3.2 對疫苗的免疫應(yīng)答機理 在體液免疫方面，用S19接種牛后，LPS通過激活B淋巴細胞，誘導(dǎo)抗體分泌，能產(chǎn)生高滴度的IgG1、IgG2和IgM，以及低濃度的IgA[19]，接種小鼠則能產(chǎn)生大量O鏈特異性的IgG1、IgG2b和IgM[20]。IgG2抗體Fc區(qū)能結(jié)合吞噬細胞上的Fc受體，促進細胞的吞噬作用和殺菌作用。[21]。

細胞免疫方面，在小鼠實驗中，接種S19后，能誘導(dǎo)強烈的Th1細胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生IL-2、TNF-α、IFN-γ，另外還誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平抗原特異性的CD4+和粒酶分泌CD8+T細胞，但不產(chǎn)生IL-4和IL-10[22]。有研究表明，牛接種S19后，特異性細胞介導(dǎo)的免疫組分被刺激，表現(xiàn)為IFN-γ產(chǎn)生和CD4+或CD8+ T細胞增加[23]。接種S19后，牛和鼠的淋巴結(jié)細胞，在體外用布魯氏菌特異性蛋白質(zhì)刺激時，與未接種疫苗的動物相比，增殖速率明顯提高[24]。

S19疫苗是光滑型布魯氏菌，其結(jié)構(gòu)中存在LPS，能刺激機體產(chǎn)生良好的體液免疫。另一方面布魯氏菌是胞內(nèi)寄生菌，機體細胞免疫對抑制布魯氏菌發(fā)揮至關(guān)重要的作用。S19疫苗激活機體細胞免疫并誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，能有效提高機體對野毒抵抗力。

3.3 疫苗改良 在血清學(xué)方法上，S19疫苗株是光滑型布魯氏菌，其LPS含有O側(cè)鏈，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體類型與野毒株誘導(dǎo)的抗體相像，這使得常規(guī)血清學(xué)檢測方法無法區(qū)分免疫動物和自然感染動物。分子生物學(xué)方法上，目前國際上廣泛使用的S19存在ery基因缺失，OIE將這一特點作為S19與野毒株鑒別診斷依據(jù)[25]。但我國使用的A19疫苗株較國外使用的S19株而言，不存在缺失情況，所以該方法不適用于A19株。尋求可鑒別診斷方法、保持良好免疫原性是S19疫苗兩個重要的研究方向。

在疫苗鑒別方面，有研究發(fā)現(xiàn)VirB8基因上108位堿基的G-T突變，可作為A19疫苗株與野生菌株的鑒別依據(jù)之一[26]；利用A19赤蘚醇代謝基因序列差異，可區(qū)分我國疫苗株A19和牛I型強毒株2308[27]，但是上述兩種方法還未能明確區(qū)分出A19疫苗株與野毒株。利用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析方法，可鑒別A19與野生菌株，但操作復(fù)雜[28]。通過檢測比對SNP位點可較快速、簡便區(qū)分S19和其它野毒株[29]；Gopaul等[30]建立的S19鑒別檢測熒光定量PCR方法，目前同樣適用于我國布魯氏菌A19疫苗株的鑒別診斷。

除對傳統(tǒng)S19疫苗差異性研究，新型疫苗的研究一直在進行。對于S19(A19)疫苗的改進，在保持其良好免疫源性和遺傳穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，可通過加入標記基因等方式，提高鑒別診斷有效性和簡便性。目前，多個候選物可用作標記基因，如：bp26基因，P39基因和綠色/紅色熒光蛋白(GFP/RFP)基因。Bp26蛋白是有效的免疫原，但有實驗證明，在缺乏Bp26蛋白的表達的情況下，并不影響S19疫苗在小鼠或懷孕母牛中的保護能力[31]。在小鼠模型中，免疫顯示蛋白P39的表達缺失不影響S19疫苗的保護功效[32]，也可以作為標記基因。具有標記基因A19-ΔVirB12突變株[33]和缺失wboA基因的RB6株[34]，其保護力和穩(wěn)定性與A19株相當，且可以有效區(qū)別野毒感染，是S19疫苗改進較成功的例子。

4 結(jié) 語

布魯氏菌病是一種嚴重的人畜共患傳染病，在布病的綜合防控措施中，至今為止，使用弱毒疫苗仍是控制動物布病的最有效的方法。S19是光滑型弱毒活疫苗，能有效刺激機體產(chǎn)生足夠且持久的保護力，毒力穩(wěn)定不返強，有效保護畜群，抵御野毒感染，降低流產(chǎn)率。S19疫苗作為世界范圍內(nèi)第一個廣泛使用的布魯氏菌活疫苗，且一直沿用至今，對全球布病防控具有相當重要的地位和意義，同時也足見該疫苗的效果長期得到認可。在臨床上，S19疫苗有其優(yōu)越性，但布魯氏菌分型眾多，單一疫苗的使用不足以完全滿足布病防控的需求，所以除S19外，還有像S2、RB51、Rev.1等其他效果良好的疫苗在使用。近些年來，世界范圍布病疫情有持續(xù)增長的趨勢，特別是我國布病疫情呈較明顯的反彈，對畜牧生產(chǎn)和公共衛(wèi)生健康存在重大威脅，加強布病防控和凈化勢在必行，優(yōu)秀的疫苗的研發(fā)和使用更顯得迫在眉睫。隨著布魯氏菌致病性及免疫原性相關(guān)的生物分子機制深入研究和當下對疫情控制與凈化的要求，新疫苗應(yīng)兼具安全性、穩(wěn)定性、高保護性、標記性于一身。

使用良好的疫苗在布病防控中是有效的措施，但要完全控制布病疫情及凈化布病，還必須配合多種外部工作，如提高對高風險群體(特別是養(yǎng)殖戶)對疾病的認知、加強預(yù)防措施和監(jiān)測水平、建立完善疫情通報及處理系統(tǒng)等。目前布病疫情廣泛且復(fù)雜，但隨著社會的重視、研究的深入，相信不久將來，以疫苗為基礎(chǔ)的綜合防治措施能從根本上降低布病的發(fā)生和傳播，最終達到布病凈化的目標。

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(編輯：李文平)

Research Progress and Application ofBrucellaabortusStrain 19

YE Jun-xian1,2，F(xiàn)ENG Yu1，CHEN Rui-ai2*，DING Jia-bo1*

(1.China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China；2.College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

CHEN Rui-ai, E-mail: chensa727@yahoo.com; DING jia-bo, E-mail: dingjiabo@ 126.com

Brucellosis is a crucial zoonosis caused by brucella，and it causes great losses to farming and theat to health of human being. Vaccination is one of the most effective measures used to control this disease. The first wiedly effective brucella vaccine wasBrucellaabortusstrain 19(S19). Nowadays,Brucellaabortusstrain 19 is still one of the most widely used brucella vaccine in the world and plays an important role in prevention of brucellosis. Both application and research progress which about theBrucellaabortusstrain 19 vaccine were reviewed in this paper in order to provide reference of using this vaccine to control brucellosis in the future and provide ideas for vaccine research.

Brucellaabortus；brucellosis；S19 vaccine

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.5.13

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0500902)

葉俊賢，碩士研究生，從事重要人畜共患病診斷技術(shù)研究。

陳瑞愛，E-mail: chensa727@yahoo.com；丁家波，E-mail: dingjiabo@ 126.com

2016-11-28

A

1002-1280 (2017) 05-0062-06

S852.61