糖尿病腎病患者血清microRNA-21含量及其與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性

馮罡，李軍，王曉麗，周婷，常向云，孫侃

（新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832008）

臨床論著

糖尿病腎病患者血清microRNA-21含量及其與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性

馮罡，李軍，王曉麗，周婷，常向云，孫侃

（新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832008）

目的分析糖尿病腎病（DN）患者血清microRNA-21（miR-21）含量及其與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性。方法選擇在該院接受治療的DN患者82例作為觀察組，根據(jù)病情嚴(yán)重程度分為輕度DN組（47例）、中重度DN組（35例），另取同期體檢健康人60例作為對(duì)照組。檢測(cè)各組患者的血清miR-21含量，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、晚期蛋白氧化產(chǎn)物（AOPP）等氧化應(yīng)激指標(biāo)水平，進(jìn)一步分析兩者之間的相關(guān)性。結(jié)果①早期DN組、中晚期DN組患者血清miR-21含量低于對(duì)照組，中晚期DN組患者血清miR-21含量低于早期DN組；②早期DN組、中晚期DN組患者血清SOD、MDA、AOPP水平高于對(duì)照組，中晚期DN組患者血清SOD、MDA、AOPP水平高于早期DN組；③血清miR-21含量與SOD、MDA、AOPP等氧化應(yīng)激指標(biāo)水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論DN患者的血清miR-21含量降低，且與患者的氧化應(yīng)激指標(biāo)水平相關(guān)，有望成為診斷及指導(dǎo)疾病治療的有效指標(biāo)之一。

糖尿病腎??；microRNA-21；氧化應(yīng)激

隨著糖尿病發(fā)病率的增加，糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率也相應(yīng)增加，其中糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的微血管慢性并發(fā)癥，終末期患者的5年生存率＜20％，預(yù)后較差[1]。對(duì)于糖尿病腎病患者的治療，原則是早期發(fā)現(xiàn)并采取積極的治療手段。目前，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制并不明確，集中于代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子等病因?qū)W說(shuō)，近年microRNA（miRNA）在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的作用引起較多學(xué)者重視。miR-21是miRNA家族的重要成員，在表達(dá)調(diào)控方面具有獨(dú)特作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-21在糖尿病腎病患者中的表達(dá)下調(diào)[2]。長(zhǎng)期的高糖水平導(dǎo)致糖尿病腎病患者處于全身氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧自由基可以進(jìn)一步促進(jìn)血糖的上升，形成惡性循環(huán)。本研究主要分析糖尿病腎病患者血清miR-21含量及其與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年5月-2015年5月在本院接受住院治療的糖尿病腎病患者82例作為觀察組。根據(jù)2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的糖尿病腎病分期標(biāo)準(zhǔn)分為早期DN組47例、中晚期DN組35例。早期DN組患者中男性26例，女性21例；年齡55～78歲，平均（70.82±8.66）歲；病程8～17年，平均（12.71± 3.29）年；中晚期DN組患者中男性20例，女性15例，年齡57～80歲，平均（69.77±7.53）歲；病程9～20年，平均（13.18±4.11）年。另取同期在本院接受健康體檢的非糖尿病腎病患者60例作為對(duì)照組，其中男性32例，女性28例；年齡54～76歲，平均（68.8±5.11）歲。各組患者基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 血清miR-21含量測(cè)定

采用苯酚氯仿抽提法進(jìn)行血清RNA抽取，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。由美國(guó)ABI公司設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）所用引物及探針，PCR總反應(yīng)體系為20 ul，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min、95℃變性15 s；60℃退火1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。樣本設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔，以ddH2O作為陰性對(duì)照。運(yùn)行程序結(jié)束后設(shè)定閾值，采用儀器自帶軟件進(jìn)行擴(kuò)增曲線分析。將1μmol/L的人工合成miR-21對(duì)應(yīng)成熟體逆轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)的cDNA，進(jìn)一步稀釋成濃度梯度后作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（X軸為濃度的對(duì)數(shù)，Y軸為每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的Ct值），最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣本的Ct值，計(jì)算樣本中miR-21的絕對(duì)含量。

1.3 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

各組患者均抽取外周靜脈血，采用羥胺法檢測(cè)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)丙二醛（Malondialdehyde，MDA），酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定晚期氧化蛋白產(chǎn)物（adanced oxidation protein products，AOPP）水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t法，相關(guān)分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miR-21含量

對(duì)照組血清中miR-21的含量為（100.00± 14.56），輕度DN組患者的血清miR-21含量為（73.82±5.77），中重度DN組患者的血清miR-21含量為（43.92±4.05），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.732，P=0.037）。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)兩兩比較，早期DN組、中晚期DN組患者血清miR-21含量低于對(duì)照組（t=5.435和8.993，P=0.045和0.012），中晚期DN組患者血清miR-21含量低于早期DN組（t= 6.923，P=0.0391）。見(jiàn)附圖。

2.2 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平

3組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)兩兩比較，早期DN組、中晚期DN組患者血清SOD、MDA、AOPP水平高于對(duì)照組，中晚期DN組患者血清SOD、MDA、AOPP水平高于早期DN組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 miR-21含量與氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的相關(guān)性

經(jīng)Pearson檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者血清miR-21含量與SOD、MDA、AOPP氧化應(yīng)激指標(biāo)水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病長(zhǎng)期血糖控制不佳導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥，與糖尿病進(jìn)程中機(jī)體全身炎癥及氧化應(yīng)激等關(guān)系密切。目前該病的發(fā)病率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)，成為終末期腎病的第2位原因[3]。糖尿病腎病患者存在復(fù)雜的代謝紊亂，其迅速進(jìn)展后往往較其他單純性腎臟疾病的治療更為棘手。在糖尿病腎病確診后對(duì)其進(jìn)行早期干預(yù)是避免疾病進(jìn)展至終末期腎病、逆轉(zhuǎn)患者預(yù)后的唯一方式。目前臨床常用的治療方式雖然可發(fā)揮一定效果，但是在延緩病情進(jìn)展方面遇到瓶頸，發(fā)現(xiàn)該病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中新的核心環(huán)節(jié)并進(jìn)行針對(duì)性治療是未來(lái)的研究方向。

近年來(lái)miRNA在疾病中的相關(guān)研究成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，某些miRNA在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮關(guān)鍵性作用，但是對(duì)于其具體作用機(jī)制仍不甚了解。miR-21是位于17q23。2號(hào)染色體上具有自主轉(zhuǎn)錄單位的miRNA，可以抑制靶基因mRNA翻譯，最終參與細(xì)胞發(fā)育、增殖及分化凋亡等眾多過(guò)程[4]。miR-21在表達(dá)調(diào)控上具有其獨(dú)特性，其表達(dá)不受重疊的蛋白編碼基因啟動(dòng)子調(diào)控。目前，已經(jīng)在諸多腫瘤患者的血液及體液中檢測(cè)到miR-21的表達(dá)，在糖尿病腎病患者中則發(fā)現(xiàn)疾病早期miR-21表達(dá)下調(diào)[5]。本研究中，首先檢測(cè)各組患者的血液中miR-21含量，結(jié)果顯示，糖尿病腎病患者的血液miR-21含量均低于對(duì)照組，在不同病情嚴(yán)重程度的糖尿病腎病患者之間，輕度DN組患者的血液miR-21含量高于中重度DN組患者，提示miR-21的表達(dá)下調(diào)參與糖尿病腎病的發(fā)病及進(jìn)展，具體機(jī)制可能是通過(guò)PTEN/AKT、TGF-β/Smad、MMP-S/T1MPS等信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)。

氧化應(yīng)激是目前公認(rèn)的在糖尿病腎病發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色，機(jī)體抗活性氧能力降低直接導(dǎo)致病情的進(jìn)展。對(duì)于糖尿病患者而言，長(zhǎng)期的高血糖水平可以誘導(dǎo)線粒體呼吸鏈自由基過(guò)量產(chǎn)生，進(jìn)一步激活多元醇、蛋白激酶C、晚期糖基化終末產(chǎn)物等多種途徑促使自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致腎臟組織氧化應(yīng)激損傷發(fā)生[6]。腎內(nèi)組織的氧化應(yīng)激損傷可以導(dǎo)致腎小球損傷、內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、高凝狀態(tài)等，還可以導(dǎo)致腎臟基質(zhì)重構(gòu)、腎小管間質(zhì)纖維化，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的全身炎癥狀態(tài)反過(guò)來(lái)也可以加重氧化應(yīng)激程度，形成惡性循環(huán)[7]。在對(duì)各組患者的血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的血清各項(xiàng)氧化應(yīng)激指標(biāo)水平大幅低于DN組患者，輕度DN組患者的血清SOD、MDA、AOPP水平低于中重度DN組患者，說(shuō)明糖尿病腎病患者處于明顯的全身氧化應(yīng)激狀態(tài)，隨著病情加重氧化應(yīng)激水平進(jìn)一步增加。

就目前的糖尿病腎病診斷及治療現(xiàn)狀而言，提高其早期診斷水平在整個(gè)治療環(huán)節(jié)中占據(jù)極為重要的位置。miR-21在糖尿病腎病中的變化敏感性及特異性均使其成為早期診斷疾病的理想指標(biāo)，同時(shí)外周循環(huán)中的血清檢測(cè)相較于組織細(xì)胞中的miRNAs檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷小等優(yōu)勢(shì)。在關(guān)于miR-21與氧化應(yīng)激指標(biāo)相關(guān)性分析方面，結(jié)果顯示，糖尿病腎病患者的血清miR-21含量與SOD、MDA、AOPP等氧化應(yīng)激指標(biāo)水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-21水平變化還可以很好地代表患者全身氧化應(yīng)激水平的變化趨勢(shì)，在糖尿病腎病的診斷及治療效果判斷及指標(biāo)方面均具有積極的臨床價(jià)值。

綜上所述，糖尿病腎病患者的血清miR-21含量降低，且與患者的氧化應(yīng)激指標(biāo)水平相關(guān)，是診斷及指導(dǎo)疾病治療的理想指標(biāo)，有望提升糖尿病腎病的早期診斷及治療水平。

[1]辛光大,周廣宇.還原型谷胱甘肽對(duì)老年早期糖尿病腎病患者氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2014,34(11):1449-1503.

[2]WANG J Y,GAO Y B,ZHANG N,et al.miR-21 overexpression enhances TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition by target smad7 and aggravates renal damage in diabetic nephropathy[J].Mol Cell Endocrinol,2014,392(1/2):163-172.

[3]朱炳銘,陳文璟,蘇運(yùn)欽,等.血清miR-21在糖尿病腎病中的診斷價(jià)值[J].中國(guó)病理生理雜志,2013,29(12):2160-2163.

[4]NAKHJAVANI M,NARGESIA A,HEIDARI B,et al.Pulse pressure does not predict the response of diabetic nephropathy to glucose-lowering therapy[J].Diab Vasc Dis Res,2015,12(2): 150-151.

[5]蔡加爐,王成,牛冬梅,等.2型糖尿病及其微血管并發(fā)癥患者血清miR-342-5p和miR-423-5p水平測(cè)定及臨床意義[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2015,33(1):24-27.

[6]BIJKERK R,DUIJSJ M,KHAIROUN M,et al.Circulating microRNAs associate with diabetic nephropathy and systemic microvascular damage and normalize after simultaneous pancreas-kidney transplantation[J].Am J Transplant,2015,15(4): 1081-1090.

[7]趙雯雯,涂曉文.MIR-21及其信號(hào)通路在糖尿病腎病中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2014,15(8):747-751.

（童穎丹 編輯）

Relationships between serum miR-21 content and oxidative stress indicators in patients with diabetic nephropathy

Gang Feng,Jun Li,Xiao-li Wang,Ting Zhou,Xiang-yun Chang,Kan Sun
(The First Affiliated Hospital,School of Medicine,Shihezi University, Shihezi,Xinjiang 832008,China)

ObjectiveTo analyze the relationships between serum miR-21 content and oxidative stress indicators in patients with diabetic nephropathy(DN).MethodsEighty-two diabetic nephropathy patients in our hospital were chosen as observation group and divided into early diabetic nephropathy group(47 cases)and advanced diabetic nephropathy group(35 cases).In the same period,60 healthy people who

physical examination were chosen as normal control group.Serum miR-21 content,and the levels of superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA)and advanced oxidation protein products(AOPP)were tested in each group,and the their correlations were further analyzed.ResultsThe serum miR-21 content in the early diabetic nephropathy group and the advanced diabetic nephropathy group was lower than that in the normal control group.The serum miR-21 content in the advanced diabetic nephropathy group was lower than that in the early diabetic nephropathy group.The serum SOD,MDA and AOPP levels in the early diabetic nephropathy and the advanced diabetic nephropathy group were higher than those in the normal control group.The serum SOD,MDA and AOPP levels in the advanced diabetic nephropathy group were higher than those in the early diabetic nephropathy group.The serum miR-21 content had negative correlations with SOD,MDA and AOPP.ConclusionsSerum miR-21 content reduces in diabetic nephropathy patients,and it is in negative correlations with the levels of oxidative stress parameters.It is expected to become one of the effective indexes fordiagnosis and treatment of diabetic nephropathy.

diabetic nephropathy;microRNA-21;oxidative stress

R587.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.012

1005-8982（2017）01-0060-04

2016-02-22

孫侃，E-mail：398146220@qq.com，Tel：13325660666