褪黑素對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響及作用機(jī)制

鄧海峰 孫縵利 楊 偉 王興紅 常全忠

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,河南 漯河 462000)

褪黑素對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響及作用機(jī)制

鄧海峰1孫縵利 楊 偉2王興紅 常全忠

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,河南 漯河 462000)

目的 探討褪黑素(MT)對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響及作用機(jī)制。方法 SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、東莨菪堿模型組和MT組。正常對(duì)照組和模型組每天腹腔注射生理鹽水2 ml；MT組每天腹腔注射MT溶劑(2 mg/kg) 2 ml，連續(xù)給藥7 d，于第8天進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，測(cè)試6 d，每天測(cè)試前30 min各組(正常對(duì)照組腹腔注射等劑量的生理鹽水)腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg。于第15天開始進(jìn)行電生理記錄。結(jié)果 ①水迷宮測(cè)試6 d后，模型組逃避潛伏期的時(shí)間(61.86±8.84)s，與正常對(duì)照組(11.13±6.08)s相比，縮短趨勢(shì)明顯較慢(P<0.01)；MT組逃避潛伏期為(16.250±10.926)s，與正常對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。水迷宮測(cè)試的第6天，模型組大鼠的穿環(huán)次數(shù)為(1.91±0.87)次，較正常對(duì)照組(3.34±0.69)次明顯減少(P<0.01)；MT組大鼠的穿環(huán)次數(shù)為(3.15±0.72)次，與正常對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。②給予100 Hz 1 s刺激后，正常對(duì)照組誘發(fā)反應(yīng)的幅度為基準(zhǔn)值的(156.36±9.69)%，MT組為(142.25±11.03)%，兩組與刺激前相比均有顯著差異(P<0.01)，模型組的幅度為基準(zhǔn)值的(108.56±12.41)%，與刺激前相比無顯著差異(P>0.05)；給予100Hz 1 s刺激后，正常對(duì)照組誘發(fā)反應(yīng)的斜率為基準(zhǔn)值的(137.31±13.74)%，MT組為(130.59±13.65)%，兩組與刺激前相比均有顯著差異(P<0.01)，模型組的斜率為基準(zhǔn)值的(101.36±11.72)%，與刺激前相比無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論 MT對(duì)東莨菪堿所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用，并且可以阻斷東莨菪堿對(duì)皮層長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的抑制。

褪黑素；東莨菪堿；學(xué)習(xí)記憶；皮層；長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)

目前阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病機(jī)制還不是很清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)在老年人和AD病人體內(nèi)褪黑素(MT)的含量明顯減少〔1〕。外源性注射一定劑量的MT對(duì)AD動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶障礙有一定的改善作用〔2〕，但作用機(jī)制還不明確。為進(jìn)一步明確MT對(duì)AD的治療機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬在在體水平采用行為學(xué)和電生理學(xué)等方法探討MT對(duì)東莨菪堿致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康雄性成年SD大鼠，體重(250±10)g，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有動(dòng)物都在自然光暗周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由覓食、飲水。動(dòng)物隨機(jī)分為3組(n=8)：正常對(duì)照組、東莨菪堿模型組和MT組。正常對(duì)照組和模型組每天腹腔注射生理鹽水2 ml；MT組每天腹腔注射MT溶劑(2 mg/kg) 2 ml，連續(xù)給藥7 d，于第8天開始造模并進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，測(cè)試6 d。

1.2 造模方法 參照Oh 等〔3〕方法于每天測(cè)試前30 min各組(正常對(duì)照組腹腔注射等劑量的生理鹽水)腹腔注射東莨菪堿1 mg/kg，直到實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束。

1.3 試劑和儀器 MT、東莨菪堿、烏拉坦均購(gòu)自Sigma公司，Morris 水迷宮裝置(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)。

1.4 Morris 水迷宮測(cè)試 Morris 水迷宮水池中加入適量的墨汁，使水池成為不透明色(去除視覺干擾)。在圓桶的上緣等距離地設(shè)東、南、西和北4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，作為大鼠進(jìn)水池的入水點(diǎn)，以這4個(gè)入水點(diǎn)在水面和水桶底部的投影點(diǎn)，將水面和水桶部分均等的分為4個(gè)象限。將平臺(tái)放置于第三象限的中間。水溫保持在22℃～23℃。大鼠訓(xùn)練：訓(xùn)練時(shí)，將大鼠面向池壁從四個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池，記錄大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺(tái)并站立于其上所需時(shí)間，作為潛伏期，大鼠找到平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立60 s。若入水后120 s大鼠未能找到平臺(tái)，則將其輕輕從水中拖上平臺(tái)，并停留10 s，然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。每只大鼠從四個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池為一次訓(xùn)練，兩次訓(xùn)練間隔30 s，用紙巾將大鼠擦干凈。

1.4.1 定位航行試驗(yàn) 觀察和記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的路線圖及所需時(shí)間，即記錄其潛伏期，歷時(shí)5 d，每天上下午各訓(xùn)練4次(各個(gè)象限)，記錄其潛伏期，上臺(tái)后休息60 s，繼續(xù)下一個(gè)象限訓(xùn)練。用于測(cè)量大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。

1.4.2 空間搜索試驗(yàn) 第6天，在定位航行試驗(yàn)后去除平臺(tái)，從同一個(gè)入水點(diǎn)放入水中，測(cè)其120 s內(nèi)穿環(huán)次數(shù)。用于測(cè)量大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后，對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力。

1.5 在體電生理記錄 20%烏拉坦(0.8 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于腦立體定位儀上。記錄電極位置(P：1.9 mm，LR：5.5 mm，H：0.8～0.9 mm)。觸須刺激由電刺激器控制氣泵產(chǎn)生氣流，由玻璃微電極導(dǎo)出，氣流方向由觸須的正下方垂直于觸須，一般引起的觸須振動(dòng)為-1 mm。當(dāng)找到對(duì)應(yīng)的主反應(yīng)觸須(PW)后，記錄單刺激誘發(fā)的皮層反應(yīng)及給予100 Hz 1 s的刺激后該誘發(fā)反應(yīng)的可塑性變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MT對(duì)大鼠定位航行試驗(yàn)的影響 隨著測(cè)試的進(jìn)行，各組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間均有縮短趨勢(shì)：正常對(duì)照組從第1天的(97.75±18.06)s 縮短到第6天的(11.13±6.08)s；模型組從第1天的(118.99±13.18)s 縮短到第6天的(61.86±8.84)s；MT組從第1天的(100.13±12.55)s 縮短到第6天 的(16.25±10.93)s。與正常對(duì)照組相比，模型組逃避潛伏期的時(shí)間縮短趨勢(shì)明顯較慢(P<0.01)；而MT組的縮短趨勢(shì)雖略慢于正常對(duì)照組，但無顯著差異(P>0.05)。這表明東莨菪堿的確可以導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，而MT對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用。

2.2 MT對(duì)大鼠空間搜索試驗(yàn)的影響 正常對(duì)照組大鼠的穿環(huán)次數(shù)為(3.34±0.69)次；模型組大鼠的穿環(huán)次數(shù)為(1.91±0.87)次；MT組大鼠的穿環(huán)次數(shù)為(3.15±0.72)次。模型組的穿環(huán)次數(shù)較正常對(duì)照組明顯減少(P<0.01)；MT組與正常對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。表明MT對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用。

2.3 MT對(duì)大鼠皮層可塑性的影響 正常對(duì)照組誘發(fā)反應(yīng)的幅度為基準(zhǔn)值的(156.36±9.69)%，MT組為(142.25±11.03)%，兩組與刺激前(100%)相比均有顯著差異(P<0.01)，模型組的幅度為基準(zhǔn)值的(108.56±12.41)%，與刺激前相比無顯著差異(P>0.05)；給予100 Hz 1 s刺激后，正常對(duì)照組誘發(fā)反應(yīng)的斜率為基準(zhǔn)值的(137.31±13.74)%，MT組為(130.59±13.65)%，兩組與刺激前(100%)相比均有顯著差異(P<0.01)，模型組的斜率為基準(zhǔn)值的(101.36±11.72)%，與刺激前相比無顯著性差異(100%，P>0.05)。提示正常對(duì)照組和MT組可以誘發(fā)突觸反應(yīng)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)，而模型組沒有誘發(fā)出LTP。這表明MT可以明顯改善東莨菪堿對(duì)大鼠皮層LTP的抑制。

3 討 論

東莨菪堿是M型膽堿能受體的拮抗劑〔4〕，易通過血腦屏障。腹腔注射東莨菪堿可以阻斷中樞乙酰膽堿與其受體的結(jié)合，使突觸間隙中過多的乙酰膽堿游離，一定范圍內(nèi)的乙酰膽堿是神經(jīng)信號(hào)傳遞的基礎(chǔ)，而過多的乙酰膽堿會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性，致使膽堿能神經(jīng)通路異?！?〕。中樞膽堿能系統(tǒng)在學(xué)習(xí)、記憶、注意力等認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，研究表明海馬、皮層以及大腦其他腦區(qū)的膽堿能神經(jīng)通路紊亂會(huì)引起學(xué)習(xí)記憶環(huán)路的調(diào)節(jié)異?！?〕，導(dǎo)致AD或其他學(xué)習(xí)記憶障礙疾病的發(fā)生。目前，東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙的動(dòng)物模型在AD研究中被廣泛運(yùn)用，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之前的報(bào)道一致。

MT是松果體分泌的一種吲哚胺類激素，具有高度脂溶性，外周給藥能通過血腦屏障而發(fā)揮作用〔6〕。之前對(duì)MT的研究主要集中在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律〔7〕、睡眠〔8〕、抗氧化〔9〕、抗癌〔10〕等多項(xiàng)生理功能方面。近年研究發(fā)現(xiàn)MT對(duì)學(xué)習(xí)記憶也有一定的調(diào)節(jié)作用，但尚無定論，有研究認(rèn)為MT對(duì)持續(xù)光照或藥物引起的學(xué)習(xí)記憶障礙有改善作用〔11〕，也有報(bào)道MT能阻斷大鼠海馬齒狀回及CA1區(qū)的突觸LTP，據(jù)此認(rèn)為MT對(duì)學(xué)習(xí)記憶有抑制作用〔12〕。這些研究結(jié)果主要是在離體水平得到的，在在體水平上的研究報(bào)道甚少。而在在體情況下，大腦內(nèi)各結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系保持完整，生理環(huán)境更穩(wěn)定，所得到的結(jié)果更能反映MT對(duì)學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)功能。

本結(jié)果表明，MT可以明顯改善東莨菪堿誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及大鼠內(nèi)皮層LTP的抑制。其機(jī)制可能是：通過血腦屏障的東莨菪堿可以引起中樞乙酰膽堿酯酶(AchE)增多〔13〕，進(jìn)而引起乙酰膽堿(ACh)水解增多，中樞ACh含量減少，而ACh可提高新生神經(jīng)元的存活率及抗凋亡，從而對(duì)學(xué)習(xí)記憶施加影響，東莨菪堿導(dǎo)致的ACh減少會(huì)造成學(xué)習(xí)記憶的損傷；MT也可以通過血腦屏障影響膽堿能系統(tǒng)，不過與東莨菪堿的作用相反，MT可以通過增強(qiáng)膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性抑制ACh過多的釋放水解〔14〕，進(jìn)而保護(hù)膽堿能神經(jīng)元，改善東莨菪堿引起的中樞膽堿能系統(tǒng)異常，從而改善記憶環(huán)路的異常。

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〔2015-06-11回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究(152300410014)；漯河醫(yī)學(xué)等?？茖W(xué)校2015年度基礎(chǔ)科學(xué)研究項(xiàng)目(2015-S-LMC06)

常全忠(1965-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究。

鄧海峰(1983-)，男，碩士，講師，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究。

R319

A

1005-9202(2017)02-0286-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.012

1 南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部 2 陽谷縣第一人民醫(yī)院康復(fù)科