加味丹參飲含藥血清對(duì)hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs促IRI大鼠心肌血管新生的影響

楊洋，黃政德，阮甦，梁暉，嚴(yán)年文，林昱，高千仞

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州350004；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410007）

加味丹參飲含藥血清對(duì)hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs促IRI大鼠心肌血管新生的影響

楊洋1，黃政德2，阮甦1，梁暉1，嚴(yán)年文1，林昱1，高千仞1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州350004；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410007）

目的探討加味丹參飲含藥血清誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165（hVEGF165）轉(zhuǎn)染后BMSCs移植IRI大鼠的心肌血管新生的影響。方法構(gòu)建hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs，將hVEGF165轉(zhuǎn)染后PIII／IV BMSCs分別加入加味丹參飲含藥血清和空白血清，體外誘導(dǎo)48 h。建立IRI大鼠模型，將實(shí)驗(yàn)大鼠分為4組，A組：假手術(shù)組；B組：IRI組；C組：hVEGF165轉(zhuǎn)染組；D組：hVEGF165轉(zhuǎn)染+加味丹參飲含藥血清組。移植第7天，HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化并做微血管計(jì)數(shù)。結(jié)果移植7 d后，與A組相比，B組心肌微血管有一定再生，C組及D組與B組相比，微血管數(shù)上升明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組與C組相比，微血管數(shù)上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論IRI大鼠模型在移植hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs后，新生血管增多，加味丹參飲含藥血清和hVEGF165轉(zhuǎn)染聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

加味丹參飲；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；hVEGF165；基因轉(zhuǎn)染；心肌缺血再灌損傷；血管新生

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）有取材方便、可來源于自身、免疫原性較低、在體外增殖能力強(qiáng)、并不涉及倫理學(xué)問題的特點(diǎn)，目前已作為一種重要的種子細(xì)胞，引起研究人員的廣泛關(guān)注［1］。BMSCs可以在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞以及骨骼、骨髓基質(zhì)、肌腱、關(guān)節(jié)和肌肉等多種組織［2］，成為目前心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

大量實(shí)驗(yàn)研究證明：中藥對(duì)干細(xì)胞的增值、定向分化有調(diào)控作用［3］。在黃芪、丹參等中藥對(duì)BMSCs的分化影響研究中發(fā)現(xiàn)：黃芪、丹參含藥血清對(duì)BMSCs的增殖具有促進(jìn)作用［4］。有研究表明黃芪甲苷具有誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的作用［5］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究［6］基礎(chǔ)上，以hVEGF165基因轉(zhuǎn)染BMSCs為切入點(diǎn)，建立大鼠心肌IRI模型，通過加味丹參飲含藥血清體外誘導(dǎo)hVEGF165基因轉(zhuǎn)染后BMSCs移植大鼠心肌IRI模型，觀察移植后第7天大鼠心肌血管新生的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及移植細(xì)胞SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，平均體質(zhì)量在（220±20）g，平均周齡12～14周，共80只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證：SCXK（湘）2009-0004，實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物倫理學(xué)要求［7］。移植用hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs：將攜有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165基因的質(zhì)粒pGLVEF1a，采用慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs。

1.2 加味丹參飲灌胃液制備本方是黃政德教授運(yùn)用“行氣活血”之法治療胸痹心痛的有效經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、赤芍、檀香、川芎、當(dāng)歸等組成，草藥由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供。除檀香外，其它藥材加雙蒸水3 000 mL浸泡30 min，回流提取2 h，濾出藥液；再加雙蒸水2 L，回流提取90 min；檀香分兩等份分別于兩次提取結(jié)束前15 min加入；合并兩次藥液，水浴濃縮至500 mL，3 500 rpm，離心10 min，取上清液；繼續(xù)濃縮至生藥濃度為1 g/mL，共250 mL，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器AIR TECH超凈臺(tái)（蘇州凈化集團(tuán)有限公司）；AX-ⅡX射線攝影暗室（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司）；倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社）；切片機(jī)（湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司）；大鼠心電圖機(jī)（江蘇玉研科儀器有限公司）；小動(dòng)物呼吸機(jī)（江蘇玉研科儀器有限公司）。

1.4 溶液配制含藥血清制備：SD大鼠平均體質(zhì)量（270±10）g，雌雄各半，平均周齡12～14周，共30只。參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［8］，按照動(dòng)物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表，成人與大鼠折算系數(shù)為6.25。按60 kg成人每天服用加味丹參飲60 g計(jì)算，大鼠臨床等效計(jì)量為60 g/60 kg×6.25＝6.25 g/kg。加味丹參飲灌胃液，按照6.25 g/kg，2次/d，連續(xù)5 d對(duì)SD大鼠進(jìn)行灌胃。腹主動(dòng)脈取血，3 000 rpm，10 min離心后吸出上部血清，得到加味丹參飲含藥血清，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆??？瞻籽逯苽洌旱葦?shù)量SD大鼠灌胃等劑量生理鹽水，2次/d，連續(xù)5 d。制備及保存方法同含藥血清。

2 方法

2.1 心肌缺血再灌注損傷模型建立符合要求SD大鼠，10%水合氯醛麻醉固定，接心電圖，剪去左側(cè)胸部3～6肋區(qū)域和頸部毛，碘伏消毒鋪單；剪刀剪開頸部皮膚，鈍性分離肌肉組織，暴露氣管，行氣管插管術(shù)，接呼吸機(jī)；剪刀剪開左側(cè)胸部皮膚，手術(shù)刀片于四五肋間沿肋間隙切開肌肉，開胸器開胸暴露心臟，鈍性分離心包，暴露心臟，在左冠狀動(dòng)脈前降支伴行靜脈旁進(jìn)針2 mm，將靜脈及伴行左冠狀動(dòng)脈前降支共同結(jié)扎。造模成功標(biāo)志：左冠狀動(dòng)脈前降支供血區(qū)心肌蒼白，心臟搏動(dòng)減弱，心電圖顯示肢體導(dǎo)聯(lián)R波振幅明顯升高，I導(dǎo)聯(lián)和aVL導(dǎo)聯(lián)J點(diǎn)明顯抬高。結(jié)扎15 min后松線，造成IRI模型。

2.2 III/IV代hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs制備及動(dòng)物分組采用全骨髓貼壁法，雌雄各半，平均體質(zhì)量（50±10）g，平均周齡3～4周，共20只SD大鼠。處死后無菌條件下取出脛骨和股骨，暴露骨髓腔，L-DMEM液反復(fù)沖洗骨髓腔。沖洗液，1 500 r/min，離心5 min，棄上清液，加入含有15%胎牛血清的完全培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液按1×108個(gè)/mL密度接種于50 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃、飽和濕度、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合基本達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。取生長(zhǎng)融合70%～80%的III/IV代hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs備用。造模成功SD大鼠隨機(jī)分組，每組10只（死亡大鼠剔除，手術(shù)組均予結(jié)扎30 min后實(shí)施干預(yù)），A組：假手術(shù)組，只穿線，不結(jié)扎；B組：IRI組；C組：在IRI模型成功后，進(jìn)行hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs移植；D組：在IRI模型成功后，進(jìn)行加味丹參飲含藥血清誘導(dǎo)的hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs移植。

2.3 加味丹參飲含藥血清最佳工作濃度采用前期研究得出促進(jìn)BMSCs分泌VEGF最佳濃度的40%加味丹參飲含藥血清為本實(shí)驗(yàn)的工作濃度［9］，取hVEGF165轉(zhuǎn)染PIII/IV代BMSCs，體外誘導(dǎo)48 h后，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，進(jìn)行細(xì)胞移植。

2.4 移植及給藥方法

2.4.1 注射位置的確定造模后，缺血心肌蒼白搏動(dòng)減弱，與正常心肌細(xì)胞的鮮紅色形成對(duì)比，此處為心肌梗死的邊緣，實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞移植注射位置。

2.4.2 注射方法A組：造模成功，在確定心肌梗死邊緣后，皮試用注射器將EP管內(nèi)細(xì)胞懸濁液吹打1～2次，使細(xì)胞懸濁液充分混勻，抽取100 μL hVEGF165基因轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞溶液；將注射器針尖部平壓于心臟外壁，待局部跳動(dòng)減弱后，刺入心肌，注入約1/3細(xì)胞溶液。同樣方法選擇另外兩注射點(diǎn)將細(xì)胞溶液注入心肌中。移植后關(guān)閉胸腔，在大鼠恢復(fù)自主呼吸后拔除氣管插管，撤呼吸機(jī)，縫合頸部皮膚；碘伏消毒創(chuàng)面，予青霉素預(yù)防感染，送回單籠飼養(yǎng)。B組：于梗死區(qū)邊緣心肌組織的3個(gè)位點(diǎn)直接注入共100 μL的L-DMEM。C組：于梗死區(qū)邊緣心肌組織的3個(gè)位點(diǎn)直接注入共100 μL的空白血清干預(yù)后hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs（細(xì)胞密度3×106）。D組：于梗死區(qū)邊緣心肌組織的3個(gè)位點(diǎn)直接注入共100 μL的加味丹參飲含藥血清誘導(dǎo)后hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs（細(xì)胞密度3×106）。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法大鼠IRI造模前后記錄心電圖，HE染色觀察心肌變化及微血管計(jì)數(shù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布用x±s表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié)果3.1IRI

大鼠心電圖的改變結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈后，Ⅱ?qū)?lián)見ST段抬高明顯，T波高聳；缺血再灌注后，出現(xiàn)病理性Q波；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，ST段下移，病理性Q波持續(xù)存在。見圖1。

3.2 心肌組織形態(tài)學(xué)改變的觀察

3.2.1 肉眼觀察心肌形態(tài)變化結(jié)扎時(shí)，可見結(jié)扎供血區(qū)心肌出現(xiàn)灰白色缺血灶，局部組織可有輕度水腫，再灌注后缺血的心肌轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。7 d后D組結(jié)扎部位供血區(qū)心肌與正常心肌顏色接近。

3.2.2 光鏡下各組7 d時(shí)心肌組織形態(tài)學(xué)變化A組：心肌細(xì)胞形態(tài)正常，纖維排列整齊有序，肌橫紋清晰規(guī)則，染色均勻。B組：缺血心肌纖維壞死，纖維瘢痕組織出現(xiàn)于心肌間質(zhì)，光鏡下可見細(xì)胞核溶解，缺血邊緣見少量血管新生。C組：缺血心肌細(xì)胞改變不如B組明顯，新生微血管較B組多。D組：缺血心肌細(xì)胞改變不如B組及C組明顯，新生微血管較B組及C組增多。見圖2。

3.3 光鏡下4組7 d時(shí)心肌微血管計(jì)數(shù)見表1。

表1 4組光鏡下微血管計(jì)數(shù)比較

表1 4組光鏡下微血管計(jì)數(shù)比較

注：與B組比較，1）P＜0.05；與C組比較，2）P＜0.05。

組別A組B組C組D組微血管計(jì)數(shù)/個(gè)13.6±2.2 15.3±1.7 18.0±1.81）22.5±2.51）2）

4 討論

胸痹心痛多發(fā)于中老年人，其特點(diǎn)為患者年齡漸高，臟腑功能隨之衰退，陽氣不足，氣不行血，心脈瘀阻；或憂思過度，肝失疏泄，氣滯則血行不暢，心脈閉阻。加味丹參飲由丹參、赤芍、檀香、川芎、當(dāng)歸、紅花、生地黃等組成，本方重用丹參為君以活血祛瘀，輔以赤芍、川芎、當(dāng)歸、紅花加強(qiáng)活血化瘀并兼養(yǎng)血行氣，佐以檀香行氣止痛。

現(xiàn)代藥理研究表明：丹參能夠增加冠狀動(dòng)脈血流量，改善微循環(huán)，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的開放，調(diào)節(jié)血液在心肌重新分布，從而保護(hù)缺血心?。?0］。赤芍中赤芍總苷可改善心肌缺血缺氧狀態(tài)，從而達(dá)到保護(hù)心肌的作用［11］。阿魏酸是川芎和當(dāng)歸有效成分，可改善血液循環(huán)，從而防止缺血對(duì)心肌的進(jìn)一步損傷［12］。

本實(shí)驗(yàn)中采用了成熟的造模方法，運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)研究加味丹參飲對(duì)IRI大鼠心肌血管新生的影響。在前期研究中，課題組得出了加味丹參飲含藥血清誘導(dǎo)BMSCs移植對(duì)心肌IRI模型大鼠梗死心肌邊緣區(qū)血管新生具有明顯的促進(jìn)作用［13］。本實(shí)驗(yàn)以hVEGF165基因轉(zhuǎn)染BMSCs為切入點(diǎn)，觀察了細(xì)胞移植后第7天心肌微血管再生情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：細(xì)胞移植組和加味丹參飲體外誘導(dǎo)的細(xì)胞移植組，與IRI組相比，均可促進(jìn)心肌微血管再生，且加味丹參飲＋hVEGF165基因轉(zhuǎn)染BMSCs移植組中微血管新生數(shù)量較其他組高。這種作用有可能是在hVEGF165基因轉(zhuǎn)染BMSCs后，促進(jìn)BMSCs血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌，誘導(dǎo)BMSCs分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)心肌血管新生的作用有關(guān)。

［1］鄒兵，謝軍平，吳清華，等.Livin基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對(duì)急性心肌梗死大鼠心功能影響［J］.中國(guó)病理生理雜志.2016，32（3）：539-543.

［2］LIU H J，HU R Y，DAI W J，et al.Culture and identification of bone marrow mesenchymal stem cells from enhanced green fluorescent protein-transgenic rats［J］.Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2016，38（1）：9-15.

［3］石景洋，唐學(xué)敏.中藥對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)分化及干細(xì)胞移植治療心腦血管疾病的影響［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（49）：2983-2986.

［4］蔡建平，張愛國(guó)，許寶滿，等.五種中藥（或方劑）含藥血清對(duì)體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性影響的篩選研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（6）：1385-1387.

［5］冼紹祥，楊忠奇，秦佳佳，等.5-氮胞苷誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化及黃芪甲苷的協(xié)同作用［J］.中國(guó)組織工程研究，2012，16（10）：1861-1865.

［6］楊洋，黃政德，田雪飛.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)［J］.中國(guó)組織工程研究雜志，2013，17（36）：6381-6387.

［7］中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部.關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見［R］.2006-09-30.

［8］魏偉，吳希美，李元建.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

［9］楊洋.加味丹參飲含藥血清對(duì)hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs移植IRI大鼠心肌血管新生的研究［D］.長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

［10］馬丙祥，董寵凱.丹參的藥理作用研究新進(jìn)展［J］.中藥房，2014，24（4）：663-665.

［11］陸小華，馬驍，王建，等.赤芍的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2015，46（4）：595-602.

［12］周鴻，黃含含，張靜澤.川芎-當(dāng)歸藥對(duì)研究進(jìn)展［J］.中成藥，2015，37（1）：184-188.

［13］趙鴻.加味丹參飲含藥血清體外誘導(dǎo)的BMSCs移植對(duì)心肌IRI模型大鼠血管新生影響的研究［D］.長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

R285.6

：A

：1000-338X（2016）06-0040-03

2016-09-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助（30973750）

楊洋（1983—），男，醫(yī)學(xué)博士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科臨床研究。

黃政德（1955—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：Hzd112 @136.com