利用連續(xù)提取法定量花生蛋白

周寧菱，邵建軍，陳紅兵，吳志華，周 煌,4

(1.景德鎮(zhèn)市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理局，江西 景德鎮(zhèn) 333000；2.景德鎮(zhèn)市食品藥品檢驗所，江西 景德鎮(zhèn) 333000；3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；4.吉安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西 吉安 343000)

利用連續(xù)提取法定量花生蛋白

周寧菱1,2,3，邵建軍1,2，陳紅兵3，吳志華3，周 煌3,4

(1.景德鎮(zhèn)市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理局，江西 景德鎮(zhèn) 333000；2.景德鎮(zhèn)市食品藥品檢驗所，江西 景德鎮(zhèn) 333000；3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；4.吉安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西 吉安 343000)

為了建立一個數(shù)學(xué)模型，用于計算花生基質(zhì)中蛋白含量，實驗將花生脫脂粉進(jìn)行五步連續(xù)提取，利用Bradford法和SDS-PAGE，分別定量出每次花生提取液中可提取的蛋白、花生過敏原蛋白Ara h 3/4和Ara h 6，用于分析提取量與提取次數(shù)的關(guān)系。結(jié)果顯示，每次蛋白提取量可用等比數(shù)列an=a1qn-1表示，根據(jù)等比數(shù)列求和公式可計算出可提取的總蛋白量。因此，利用五步連續(xù)提取法獲得的數(shù)學(xué)模型可作為一種計算花生基質(zhì)中蛋白含量的方法。

花生蛋白；定量；提取；Ara h 3/4；Ara h 6

1 引言

花生中含25%—36%蛋白[1]，含量高且營養(yǎng)價值豐富，受到廣泛重視和利用?；ㄉ鞍椎慕M分、含量、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是進(jìn)行生物研究和精深加工的重要基礎(chǔ)。通常，花生粗蛋白可采用凱氏定氮法，花生提取液中總蛋白量可采用Bradford法[2]和BCA法[3]等方法，單種蛋白可配合灰度分析法計算，另外花生提取液中過敏原含量可采用ELISA法[4]。在上述定量方法中，凱氏定氮法主要用于測定固體基質(zhì)中蛋白量，但耗時，靈敏度不高；Bradford法和ELISA法均具有快速、易操作、高靈敏度、干擾少等特點，受到實驗室廣泛的運用，但兩者只能檢測提取液中蛋白量，不能反映花生基質(zhì)中總蛋白或者單種蛋白含量的完整信息。而在花生蛋白研究中，定量基質(zhì)中的蛋白是非常重要的。遺憾的是，目前，尚未見檢測花生基質(zhì)中單種蛋白的定量檢測方法的相關(guān)報道。

在蛋白提取過程中，提取次數(shù)、溫度、速率、時間、提取劑等因素均會影響提取效果[5]，導(dǎo)致提取出的蛋白含量或種類存在差異。在以往的研究中，大部分是通過優(yōu)化提取條件，增加提取量，但未見對提取次數(shù)與蛋白提取量關(guān)系進(jìn)行研究的相關(guān)報道。因此，本研究以花生單種蛋白Ara h 3/4[6]和 Ara h 6[7]為例，采用五次連續(xù)提取蛋白實驗，探究經(jīng)多次提取后花生蛋白含量和種類的變化規(guī)律，以期建立一個數(shù)學(xué)模型，用于計算出花生基質(zhì)中蛋白的含量。

2 材料與方法

2.1 材料

22個品種花生

2.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)；RH basic 2 S25型磁力攪拌器(德國IKA LABORTECHNIK)；TS-3型脫色搖床(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；FDV型超細(xì)粉碎機(jī)(北京興時利和科技發(fā)展有限公司)；迷你蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；GS-800掃描儀(北京宇艾奇科技有限公司)；BR 680型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；MVS-1型漩渦混合器(北京北德有限公司)；PB-10型pH計(德國Sartorius公司)。

2.3 實驗方法

2.3.1 花生蛋白的提取[8]

(1)花生脫脂

花生仁(贛花7號)，去種皮，用低溫粉碎機(jī)粉碎，用丙酮按1:5(W/V)低溫攪拌，脫脂2 h，低溫離心30 min，棄上清，取沉淀重復(fù)脫脂2次，最終將沉淀自然風(fēng)干得花生脫脂粉，-20 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

(2)花生蛋白的連續(xù)提取方法

花生脫脂粉2.00 g用浸提液(50 mM Tris-HCl緩沖液，(pH8.0) ，1:5 (W/V))低溫浸提2 h，低溫離心30 min，所得上清液即為第一次提取液。剩下沉淀同提取步驟一繼續(xù)提取，連續(xù)提取四次，記錄每次提取液體積。所得提取蛋白液分別凍存于-20 ℃下以備用。

2.3.2 花生蛋白含量的測定

花生粗蛋白含量采用凱氏定氮法測定，測得的含氮量乘以蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化系數(shù)即為粗蛋白含量，此處蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化系數(shù)定為5.46[9]。

花生蛋白提取液濃度采用Bio-Rad公司的商業(yè)化定量試劑盒測定，原理為Bradford蛋白測定法。所有蛋白含量測定均重復(fù)三次。

2.3.3 SDS-PAGE

5次蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE[10]實驗，根據(jù)蛋白電泳凝膠的圖像，對提取液進(jìn)行定性和定量分析。其中Ara h 3/4和Ara h 6的相對含量借助quantity one軟件計算。

2.3.4 不同品種花生的蛋白提取

選取21個花生品種(泉花726，沙坡，忻縣大花生，ICGV87281，8405-3，大倫花生1 ，桂花22，白馬紅，桂花26，西農(nóng)花，桂花H771，升平，7501-11，閩花6號，秧道紅，猛豆，昌花1號，邦機(jī)紅，魯花，0475，桂花30)進(jìn)行上述的脫脂、連續(xù)提取、蛋白含量的測定及SDS-PAGE實驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 花生總蛋白的數(shù)量分析

通過凱氏定氮法測得2 g桂花26花生脫脂粉中含粗蛋白1 050.1±13.1 mg?；ㄉ撝劢?jīng)五次連續(xù)提取后，提取液濃度采用Bradford蛋白定量法測定，其測得的蛋白量(±標(biāo)準(zhǔn)差SD)分別是700.93±46.95 mg、198.09±23.46 mg、67.99±16.28 mg、24.35±9.00 mg、9.96±1.18 mg。五次提取液中可提取的蛋白量合計1 001.3 mg，略低于花生粗蛋白量。其中，第一次提取液中含有的蛋白量約占66.8%的粗蛋白，而第三次提取的蛋白量只占粗蛋白量的6.5%。因此，在以前的蛋白提取率研究中，經(jīng)第二次提取后剩余的殘渣中含有的蛋白量極少，一般都會被丟棄。

實驗結(jié)果如圖1所示，花生蛋白經(jīng)連續(xù)提取后，其提取率分別為66.8%、56.7%、45.0%、29.3%和17.0%，呈現(xiàn)良好的負(fù)線性關(guān)系(y=-12.694x+81.054，R2=0.994 3，其中x代表提取次數(shù)，y代表蛋白提取率)。由此可見，在理論上，經(jīng)多次提取，花生蛋白是可以被完全提取的。同時，由圖1可知，蛋白提取量與提取次數(shù)的關(guān)系可用指數(shù)關(guān)系式y(tǒng)=1 792.5e-1.060 3x(R2=0.996 0，其中x代表提取次數(shù)，y代表蛋白提取量)表示。隨著提取次數(shù)的增加，蛋白的提取量顯著降低。多次重復(fù)實驗結(jié)果顯示，這種規(guī)律可用指數(shù)方程的公式y(tǒng)=Aekx(A和k為常數(shù))表示。當(dāng)提取次數(shù)x從1次逐漸增加到5次時，蛋白提取量分別為Aek,Ae2k,Ae3k,Ae4k,Ae5k，這種數(shù)據(jù)變化趨勢可用數(shù)學(xué)中的等比數(shù)列通式an=a1qn-1表示,a1=Aek,q=ek, 當(dāng)x趨于無窮大時即提取無數(shù)次，可用等比數(shù)列求和公式Sn=a1/(1-q)計算出花生基質(zhì)中可提取的蛋白量為945.1 mg，約占粗蛋白量的90.0%，基于花生基質(zhì)中含有無法提取的結(jié)構(gòu)蛋白或者不溶性蛋白，此計算數(shù)據(jù)是合理的。

圖1 蛋白提取量與提取率在連續(xù)提取中的變化

3.2 花生蛋白Ara h 3/4和Ara h 6的含量分析

五次連續(xù)提取液經(jīng)測定濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE實驗，如圖2所示。從圖2可知，每次提取液的蛋白譜圖的模式相似，即蛋白組分種類并沒有顯著差異。而利用quantity one軟件分析，可知過敏原Ara h 3/4和Ara h 6占每次提取液中的含量比存在一定的差異。在1-5次提取液中，Ara h 3/4的含量百分比分別為27.76±1.7%，31.95±1.85%，38.30±4.19%，38.83±5.74%，45.80±7.52%，隨著提取次數(shù)的增加，Ara h 3/4的含量比逐漸增加，呈現(xiàn)良好的正相關(guān)性y=4.295x+23.65(R2=0.959 9)；而Ara h 6的含量百分比分別為6.90±0.68%，6.26±0.89%，6.92±0.99%，6.60±0.53%，6.79±0.95%，五次含量比的偏差在0.28，變化并不顯著。由此可見，提取次數(shù)不同，每次提取液中蛋白組分的含量比存在一定的差異。

由圖3可看出Ara h 3/4的提取量與提取次數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)相關(guān)性，方程為y= 450.7e-0.940 7x，R2=0.995 5。由于總蛋白與過敏原蛋白Ara h 3/4、Ara h 6的提取過程是在同一條件下，因此，利用數(shù)學(xué)模型計算花生基質(zhì)中蛋白量的方法也適用于Ara h 3/4和Ara h 6。因此，通過指數(shù)方程y=Aekx與求和公式Sn=a1/(1-q)，可計算出花生基質(zhì)中Ara h 3/4的含量約為286.0 mg，約占粗蛋白的27.2%。同時，Ara h 6的提取量與提取次數(shù)也呈現(xiàn)相似的指數(shù)相關(guān)性，方程為y=119.12e-1.0582 x(R2=0.993 9)，利用數(shù)學(xué)模型計算出花生基質(zhì)中Ara h 6的含量約為63.0 mg，約占粗蛋白量的6.0%。

圖3 Ara h 3/4和Ara h 6在連續(xù)提取中提取量的變化

3.3 不同花生品種的蛋白含量分析

為了驗證蛋白提取量與提取次數(shù)之間的指數(shù)相關(guān)性的真實性，除了利用重復(fù)實驗驗證外，還探索了不同品種花生經(jīng)脫脂、連續(xù)提取后，蛋白提取量與提取次數(shù)的關(guān)系。

由表1可知，隨機(jī)選取的21份花生品種均存在此類規(guī)律，即蛋白提取量與提取次數(shù)的關(guān)系均可用指數(shù)方程式表示，相關(guān)性的變化幅度為0.92—0.99。方程式計算的蛋白量與粗蛋白量的比值變化幅度為89%—130%，對于大部分花生品種，該比值集中于100%—110%。由此可見，蛋白提取量與提取次數(shù)的指數(shù)相關(guān)性是普遍存在于不同花生品種之間的，這進(jìn)一步驗證了利用數(shù)學(xué)模型計算花生基質(zhì)中蛋白量的可行性。

同時，在所選取的22份花生品種中，利用此數(shù)學(xué)模型計算出的粗蛋白理論值有的高于實際測定值，有的低于實際測定值。造成此結(jié)果的影響因素可能包括：第一，本實驗是利用 數(shù)學(xué)模型中擬合的指數(shù)方程y=Aekx計算蛋白量，這要求方程式具有較高的相關(guān)系數(shù)R2，而受花生品種、實驗條件、實驗操作和工作量等影響，使得一部分花生品種對應(yīng)的方程式R2并不高，影響計算結(jié)果；第二，實驗中采用的提取方法較為溫和(提取溫度4 ℃，攪拌速度低)，而無法在5次提取中獲得花生基質(zhì)中的全部蛋白；第三，Bradford定量法所致，該方法原理是利用考馬斯亮藍(lán)G-250所含的疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)之間的親和結(jié)合作用，而不同品種花生蛋白提取液中蛋白種類和性質(zhì)不同，蛋白疏水性會有所差異。同時，曾有報道，Bradford定量法可能會低估大多數(shù)種類的蛋白含量[11]；第五，凱氏定氮法所致，該方法測定的是有機(jī)氮含量，測得的花生粗蛋白量可能雜含一些含氮的非蛋白物質(zhì)(硝酸鹽、亞硝酸鹽、核苷酸、核酸和多糖等)，甚至一些難溶或不溶蛋白，而本實驗中計算出的蛋白量為可溶性蛋白量。

表1 不同花生品種的蛋白提取量與提取次數(shù)的關(guān)系

品種擬合方程式相關(guān)性R2凱氏定氮測定量/mg5次提取總量/mg計算總量Sn/mgSn與凱氏定氮測定量比值/%泉花726y=1176．8e-0．8995x0．9923903．31797．31806．9389．33沙坡y=753．04e-0．7122x0．9969796．68715．77725．1491．02忻縣大花生y=883．08e-0．7963x0．9920796．39726．35725．4391．09ICGV87281y=675．5e-0．6273x0．9669845．46731．24774．1791．578405?3y=1166．5e-0．8297x0．9194867．80862．07804．5192．71大倫花生1y=541．04e-0．5363x0．9750793．60698．66762．3896．07桂花22y=1011．2e-0．7686x0．9961891．45864．76874．1898．06白馬紅y=1350．6e-1．1527x0．9954633．02654．68623．3698．48桂花26y=2125．9e-1．1606x0．9899972．49999．03969．9199．74西農(nóng)花y=924．18e-0．7002x0．9852908．20867．88911．28100．34桂花H771y=1410．2e-1．0358x0．9884751．71751．73775．96103．23升平y(tǒng)=1655．7e-1．0217x0．9963860．34929．27931．26108．247501?11y=1296e-0．8712x0．9916850．45941．60932．52109．65閩花6號y=1443．7e-0．9152x0．9772865．51946．85964．22111．40秧道紅y=1065．5e-0．7695x0．9684808．44854．91919．58113．75猛豆y=1261．1e-0．7913x0．9441902．501011．051045．46115．84昌花1號y=1298．9e-0．8754x0．9894794．59955．12927．90116．78邦機(jī)紅y=1404．7e-0．9416x0．9505747．34827．30898．10120．17魯花y=2024．2e-1．0483x0．9891892．131036．851092．51122．460475y=1681e-0．8756x0．9958961．221166．281200．44124．89桂花30y=1272．7e-0．6952x0．9548974．611206．181267．49130．05

4 結(jié)論

本實驗采用5次連續(xù)提取和Bradford蛋白定量法探索蛋白提取量與提取次數(shù)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以用指數(shù)方程式y(tǒng)=Aekx表示此關(guān)系，結(jié)合指數(shù)極限求和公式Sn=a1/(1-q)建立了一個可以計算花生基質(zhì)中蛋白含量的數(shù)學(xué)模型。在研究中，分別用粗蛋白、兩個單種蛋白和22個花生品種進(jìn)行驗證，增加數(shù)學(xué)模型的可信度。

植物基質(zhì)中單種蛋白含量的測定在蛋白研究中起著至關(guān)重要的作用，在今后的實驗中，還可對除花生以外的植物進(jìn)行探究，以期獲得相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型計算植物基質(zhì)中蛋白含量。

[1] 劉大川. 植物蛋白工藝學(xué)[J]. 北京：中國商業(yè)出版社, 1993.

[2] Bradford M M. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976,72:248-254.

[3] 李海玲，彭書明，李凜，等. 4種常用蛋白濃度測定方法的比較[J]. 中國生化藥物雜志, 2008，29(4)：277-282.

[4] 邵景東，孫秀蘭，張銀志，等. 酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測花生過敏原的研究[J]. 分析科學(xué)學(xué)報，2011，27(1)：89-92.

[5] 楊偉強，李鵬，袁濤，等. 從花生蛋白粉中提取花生分離蛋白的條件優(yōu)化[J]. 中國油脂, 2009，34(1):34-37.

[6] Marsh Justin,Rigby Neil,Wellner Klaus,et al. Purification and characterisation of a panel of peanut allergens suitable for use in allergy diagnosis[J]. Molecular Nutritrion Food Research, 2008,52:S272-S285.

[7] Jin Tengchuan,Guo Feng,Wei Chen Yu,et al. Crystal structure of Ara h 3, a major allergen in peanut[J]. Molecular Immunology, 2009,46(8-9):1796-1804.

[8] Luo Chunping,Hu Chunqiu,Gao Jinyan,et al. A potential practical approach to reduce Ara h 6 allergenicity by gamma irradiation[J]. Food Chemistry, 2013,136(3-4):1141-1147.

[9] Misra J B. Variation in Nitrogen-to-Protein Conversion Factor for Peanut[J]. Peanut science, 2001,28(2):48-51.

[10] Laemmliu. Cleavage of structuralproteinsduring the assembly of the head of the bacteriophage T4[J]. Nature, 1970,227:680-685.

[11] Hildebrandt S,Steinhart H,Paschke A. Comparison of different extraction solutions for the analysis of allergens in hen's egg[J]. Food Chemistry, 2007,108(4):1088-1093.

Quantification of peanut protein by sequential extraction

ZHOU Ning-ling1,2,3, SHAO Jian-Jun1,2,CHEN Hong-bing3,WU Zhi-hua3,ZHOU Huang3,4

(1. Jingdezhen Market and Quality Supervision Administration, Jingdezhen 333000, China;2. Jingdezhen Institute for Food and Drug Control, Jingdezhen 333000, China;3. State Key Laboratoryof Food Science, Nanchang University, Nanchang 330047, China;4. Ji’an Vocational and Technical College, Ji’an 343000,China)

In order to establish a mathematical model for calculating the matrix peanut protein,a five-step sequential extraction method on defatted peanut flour (DPF) was put forward in the study. After each extraction, the extracted protein, peanut allergen Ara h 3/4 and Ara h 6 were quantified by Bradford and SDS-PAGE with the aim of analyzing the relationship between the extracted protein content and extraction times. The results showed that a geometric sequencean=a1qn-1was obtained. Using the mathematical summation formula, the protein content in peanut matrix could be calculated. So, the using of five-step sequential extraction method could provide a means to quantify certain protein in peanut matrix.

peanut protein; quantification; extraction; Ara h 3/4; Ara h 6

2016-03-29.

2016-10-10.

周寧菱(1989-)，女，實驗員，碩士，E-mail：zhouningling@sina.cn.

2095-7386(2016)04-0017-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.04.003

TS 201.2

A