赤雹根總皂苷緩釋片含量測定的方法學研究

田沂凡，劉春楠，佟繼銘，劉永平

(河北省中藥開發(fā)與研究重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，承德 067000)

赤雹根總皂苷緩釋片含量測定的方法學研究

田沂凡，劉春楠，佟繼銘，劉永平*

(河北省中藥開發(fā)與研究重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，承德 067000)

目的：建立赤雹根總皂苷(TSTR)緩釋骨架片的含量測定方法。方法：采用單因素考查的方法考查溶出條件對藥物體外釋藥可能產生的影響，對TSTR緩釋骨架片的含量測定方法進行方法學考查。結果：赤雹皂苷F在4.84～309.76 μg/ml范圍內呈良好的線性關系(r=0.999 7)。藥物的體外釋放條件為：以500 ml脫氣后的pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)作為溶出介質，溫度為(37±0.5) ℃，轉速為100 r/min。結論：建立了穩(wěn)定可靠的TSTR骨架緩釋片的含量測定方法。

赤雹根，總皂苷，含量測定，骨架緩釋片

赤雹為葫蘆科多年蔓生草本植物，是我國滿族民間長期沿用藥材，多用來治療風濕腰腿痛、軟組織損傷[1]。前期研究表明，TSTR具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用[2,3]，對佐劑誘導的類風濕性關節(jié)炎大鼠治療效果明顯[4,5]。本試驗針對臨床治療類風濕性關節(jié)炎普通片劑給藥頻繁等缺點，并結合前期研究，制備TSTR緩釋片，并對TSTR緩釋片含量測定的方法學進行考查，預期建立穩(wěn)定可靠的TSTR骨架緩釋片的含量測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent HPLC-1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；依利特色譜柱(Hypersil ODS2，250 mm×4.6 mm，5 μm，批號11109)；ZDY-8型重型單沖壓片機(上海遠東制藥機械總廠)；RC806溶出試驗儀(TDTF/天大天發(fā))；YP1200型電子天平(上海精科天美科學儀器有限公司)；AG-245型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；YPD-300型片劑硬度儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；熱風循環(huán)干燥箱(吳江華飛電熱設備有限公司)。

1.2 試藥 赤雹根總皂苷(TSTR，實驗室自制，純度大于50%)；赤雹皂苷F(實驗室自制，純度大于96%)；甲醇、乙腈均為色譜純；羥丙甲纖維素(HPMC K4M、HPMC K15M、HPMC K100M，安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號依次為140607、141017、140209)；微晶纖維素(B型，湖州展望藥業(yè)股份有限公司，批號20150631)；硬脂酸鎂(湖州展望藥業(yè)股份有限公司，批號20150604)；羧甲淀粉鈉(CMS-Na，湖州展望藥業(yè)股份有限公司，批號20150233)；聚維酮 K30(PVP K30，湖州展望藥業(yè)股份有限公司，批號20150410)；純凈水(高碑店娃哈哈啟力飲料有限公司)；氫氧化鈉(分析純，天津市佳興化工玻璃儀器工貿有限公司)；磷酸二氫鉀(分析純，西隴化工股份有限公司)。

2 方法與結果

2.1 TSTR緩釋片的制備 綜合考慮TSTR的提取率，擬定片重450 mg，每片中TSTR干膏150 mg。根據赤雹根藥材的常用劑量考慮，擬定服用方法為：1次/d，2片/次。由前期預試驗得知，當TSTR作為主藥時，由于TSTR干膏本身具有一定的黏度，濕法制粒后片劑硬度過大，不利于緩釋的進行，故根據輔料性質及其余輔料的組成，將TSTR與各輔料充分混合，采用粉末壓片法直接壓片即得。

2.2 體外釋放條件的考查

2.2.1 溶出介質對藥物體外釋放的影響 釋放介質的選擇與藥物的理化性質、生物學特性及服用后所遇到的生理環(huán)境等因素有關。模擬人體胃腸道的生理環(huán)境，考查不同的pH值下溶出介質對藥物釋放的影響，對于研究藥物服用后在不同生理環(huán)境下的敏感性及不同處方在不同釋放介質中的釋藥差異具有重大意義[6]。本研究根據人體胃腸道中的生理環(huán)境不同，選擇三種不同pH值下的釋放介質，即1 mol/L的稀鹽酸、脫氣后的新鮮蒸餾水、pH 6.8的PBS緩沖液[7]。取上述同一批次制備的TSTR骨架緩釋片各1片，分別在以上3種不同的釋放介質中溶出，在相同位置定時取樣，每次取樣1 ml迅速過濾。以赤雹皂苷F的累積釋放度為評價指標，采用HPLC法測定每一份樣品的峰面積，計算其累積釋放度。結果見圖1。由圖1可知，溶出介質對藥物的體外釋藥過程影響較大，藥物在人工胃液環(huán)境中的累積釋放度較低，在水和pH 6.8的PBS緩沖液中緩慢釋放，符合Higuchi釋放曲線。結果表明藥物具有良好的體外緩釋作用，無明顯突釋。

圖1 不同溶出介質對皂苷F體外釋放的影響

2.2.2 溶出介質溫度的選擇 溶出介質溫度對藥物體外釋放的影響大小主要由藥物與輔料的溶解性所決定。人體正常體溫為(37±0.5) ℃，《中國藥典》一部2015版規(guī)定溶出介質溫度為(37±0.5) ℃，更能夠準確反應藥物在體內的釋藥過程。

2.2.3 轉速對藥物體外釋放的影響 采用籃法對同一批次的TSTR緩釋片進行體外釋放測定試驗，考查轉速對體外釋藥行為的影響，轉速分別設定為50 r/min和100 r/min，保持其他條件不變，按照“2.2.1”項下方法測定其累積釋放度。結果見圖2。由圖2可知，轉速大小對藥物的體外釋放速率影響較大，其大小與藥物體外釋放速率呈正相關關系。溶出度測定方法中轉速的大小范圍一般在50～100 r/min，籃法和槳法分別以100 r/min、50 r/min為主[8]。測定藥物體外釋放度時轉速應選擇100 r/min。

圖2 轉速不同時對皂苷F體外釋放的影響

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 Discovery-C18色譜柱(Hypersil ODS2，250 mm×4.6 mm，5 μm，批號11109)；流動相：乙腈-水(24∶76)；檢測波長：200 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl[9]。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定赤雹皂苷F 10 mg，用25%乙腈水溶解并定容至10 ml，分別精密量取上述標準液3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1和0.05 ml于10 ml量瓶中，用25%乙腈水定容，搖勻，即得對照品溶液。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取預制備的TSTR緩釋片研碎后的粉末10 mg，用25%乙腈水超聲溶解并定容至10 ml，搖勻，即得。

2.3.2.3 陰性對照溶液 取TSTR緩釋骨架片的陰性制劑，粉碎，混勻后精密稱取20 mg，置于10 ml量瓶內，加25%乙腈水超聲30 min后定容，搖勻。過0.45 μm濾膜，精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μl，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，對比樣品和對照品的HPLC圖譜，空白制劑的HPLC圖譜在58 min左右赤雹皂苷F出峰處沒有干擾峰。結果見圖3。

1.赤雹皂苷F圖3 供試品(A) 對照品(B)陰性對照(C)HPLC色譜圖

2.3.3 標準曲線的制備 分別取上述對照品溶液各1 ml于上樣瓶中，按照上述色譜條件進樣，測定其每份對照品溶液的峰面積。以對照品峰面積值(Y)為縱坐標，赤雹皂苷F的濃度X(μg/ml)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程：Y=11 148X-40 230(r=0.999 7)。表明赤雹皂苷F在4.84～309.76 μg/ml范圍內呈良好的線性關系。

2.3.4 精密度試驗 移取40 μg/ml的對照品溶液各1 ml于上樣瓶中。按照“2.3.1”項下色譜條件重復進樣6次，并記錄峰面積。結果6份供試品的峰面積均值為369 600，RSD為0.77%，表明該儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 移取供試品溶液1 ml于上樣瓶中。按照“2.3.1”項下色譜條件分別在1、2、4、8、12和24 h進樣1次，測定樣品的峰面積。結果所測得峰面積的平均值為455 825，RSD為0.31%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重現性試驗 取5份TSTR緩釋片粉末各10 mg于10 ml量瓶內，加25%乙腈水超聲溶解并定容至10 ml，各取1 ml于上樣瓶中，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣，測定其峰面積并記錄。結果所測得TSTR緩釋骨架片中赤雹皂苷F含量的平均值為4.45%，RSD值為0.50%，表明該方法重現性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱定9份已知赤雹皂苷F純度的TSTR緩釋片粉末各10 mg于10 ml量瓶中，依次編號1～9號，1～3號、2～6號和7～9號量瓶內依次加入0.36、0.45和0.53 mg的對照品，分別加入25%乙腈水超聲溶解30 min，定容至10 ml。按“2.3.1”項下色譜條件依次測定其峰面積，并計算加樣回收率。平均回收率為101.1%，RSD為1.27%。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=9)

2.3.8 緩釋片中赤雹皂苷F的含量測定 取預制備的TSTR緩釋片(片重依次為458、452和457 mg)3片，粉碎后分別置于3支500 ml量瓶內，加純水超聲溶解并定容。在“2.3.1”項色譜條件下分別測定以上3份樣品中赤雹皂苷F的含量。結果見表2。

表2 緩釋片中赤雹皂苷F的含量測定結果

3 討論

根據《中國藥典》規(guī)定，緩釋制劑在體外釋放過程中，溶出介質的體積一般為500～900 ml。預試驗結果發(fā)現，當溶出介質為900 ml時，皂苷F在溶出介質中的濃度過低，小于含量測定的線性范圍，通過對比不同體積對結果的影響，最終確定溶出介質的體積為500 ml。

通過對陰性制劑、TSTR緩釋骨架片樣品和赤雹皂苷F對照品的HPLC譜圖進行比較，陰性制劑譜圖在赤雹皂苷F的保留時間附近未出現干擾峰，說明骨架材料和輔料對赤雹皂苷F的HPLC檢測沒有影響。

1 宋立人，紅恂，丁緒亮，等．現代中藥大辭典(上冊)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：1022

2 劉永平，陳建雙，張玉玲，等.赤雹根總皂苷鎮(zhèn)痛作用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2001,38(5):993-995

3 陳建雙，張玉玲，趙波，等.赤雹根總皂苷抗炎作用研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012,18(8):163-166

4 張玉玲，趙波，陳建雙，等．赤雹根鎮(zhèn)痛作用及有效部位研究[J]．時珍國醫(yī)國藥，2010，21(10)：2483-2484

5 劉永平，陳建雙，趙波，等．赤雹根總皂苷對實驗性佐劑型關節(jié)炎鎮(zhèn)痛作用的研究[J]．遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(8)：1659-1661

6 周松，陳騰.鹽酸偽麻黃堿緩釋制劑的研制及其體外釋放度測定[J].中國藥師，2006,9(8):60-62

7 彭芝萍.三七總皂苷緩釋片的制備工藝及其體內外釋藥的研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學，2012：28-29

8 魏農農，王霞，蘇敏.藥物溶出度試驗方法研究進展[J].中國新藥雜志，2013,22(17):1119-1124

9 毛曉霞，苗光新，趙春穎，等.赤雹根中Dubioside F的分離純化及含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2014,20(24):62-65

安全用藥

2016-09-13

河北省科技廳支撐項目(No.14272502D)，河北省教育廳重大項目(No.ZD 2016013)

R927.2

A

1006-5687(2016)06-0024-03

*通訊作者:劉永平，E-mail:lyp@cdmc.edu.cn。