注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)含量測(cè)定方法的研究

陳愛(ài)萍，朱雪萍，戴云志

(南京優(yōu)科生物醫(yī)藥有限公司，南京 210029)

注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)含量測(cè)定方法的研究

陳愛(ài)萍，朱雪萍，戴云志

(南京優(yōu)科生物醫(yī)藥有限公司，南京 210029)

目的：建立同時(shí)測(cè)定注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)中頭孢噻肟和他唑巴坦含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液(6.7 g磷酸二氫鉀，3 ml磷酸，2 ml四丁基氫氧化銨，用水溶解并稀釋至1 000 ml)(27∶73)，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果:頭孢噻肟和他唑巴坦的進(jìn)樣量分別在0.516～4.124 μg和0.083～0.663 μg范圍內(nèi)和各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系(r=1)；平均加樣回收率分別為100.6%和100.4%，RSD分別為0.79%和0.94%(n=9)。結(jié)論:該方法操作簡(jiǎn)便，專屬性和耐用性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可同時(shí)測(cè)定注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)中頭孢噻肟和他唑巴坦的含量。

高效液相色譜法，頭孢噻肟，他唑巴坦，含量測(cè)定

頭孢噻肟鈉為第三代頭孢菌素，抗菌譜廣，對(duì)大腸埃希菌、克雷伯菌屬等革蘭陰性菌有強(qiáng)大活性。在臨床上頭孢噻肟鈉主要用于敏感細(xì)菌所致的肺炎及其他下呼吸道感染、尿路感染、腦膜炎、敗血癥、腹腔感染、盆腔感染、皮膚軟組織感染、生殖道感染、骨和關(guān)節(jié)感染等，還可以作為小兒腦膜炎的首選藥物。但頭孢噻肟易被β-內(nèi)酰胺酶水解而失去活性，衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)基礎(chǔ)網(wǎng)(MOH National Antimicrobial Resistant Investigation Net，Mohnarin) 近年來(lái)對(duì)于成人感染患者的調(diào)查結(jié)果顯示[1-3]：常見(jiàn)致病菌，特別是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)于頭孢噻肟的耐藥率逐年增高，腸桿菌科主要致病菌對(duì)于頭孢噻肟的耐藥率基本在50%以上，最高已達(dá)70%左右。他唑巴坦鈉是目前上市的最強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑[4]，二者聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)是頭孢噻肟和他唑巴坦按6∶1(w/w)組成的復(fù)方制劑，可有效克服因ESBLs引起的耐藥，并能阻斷或延緩耐藥的繼續(xù)發(fā)展，是一個(gè)安全、有效的復(fù)方抗生素，屬于化藥1.5類新藥。本文建立反相高效液相法同時(shí)測(cè)定頭孢噻肟和他唑巴坦含量。

1 儀器與試藥

LC-1260高效液相色譜系統(tǒng)(含1260Quat PumpVL泵、1260ALS自動(dòng)進(jìn)樣器、1260TCC控溫箱、1260VWD紫外檢測(cè)器和OpenLAB色譜工作站，安捷倫)；AL204型電子分析天平(德國(guó)梅特勒儀器公司)；BP211D型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯儀器公司)； 320-S pH計(jì)[梅特利-托利多儀器(上海)有限公司]。頭孢噻肟對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)130480-200903，含量83.7%)；他唑巴坦對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)130511-200402，含量99.1%)；注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉粉針劑(6∶1)(南京優(yōu)科制藥有限公司，批號(hào)20140401、20140402、20140403)。磷酸二氫鉀、10%四丁基氫化銨和磷酸均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇為色譜純，購(gòu)自Merck公司；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-磷酸二氫鉀溶液(6.7 g磷酸二氫鉀、3 ml磷酸、2 ml四丁基氫氧化銨，用水溶解并稀釋至1 000 ml)(27∶73)；流速為1.0 ml/min；波長(zhǎng)為220 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μl；運(yùn)行時(shí)間12 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白對(duì)照溶液 以流動(dòng)相做為空白對(duì)照溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 取頭孢噻肟和他唑巴坦對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml分別含頭孢噻肟100 μg、他唑巴坦17 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的配制 精密稱取注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml分別含頭孢噻肟100 μg、他唑巴坦17 μg的溶液，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白對(duì)照溶液各20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。頭孢噻肟主峰保留時(shí)間為8.515，理論塔板數(shù)為9 195，峰純度為1 000；他唑巴坦主峰保留時(shí)間為4.547，理論塔板數(shù)為10 461，峰純度為1 000，兩主成分在220 nm均有最大吸收。頭孢噻肟和他唑巴坦主峰的分離度符合要求，主峰與各個(gè)雜質(zhì)峰分離度也均符合要求，空白對(duì)照對(duì)檢測(cè)沒(méi)有影響。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線性范圍考查 精密稱取頭孢噻肟對(duì)照品和他唑巴坦對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml約含頭孢噻肟100 μg、他唑巴坦17 μg的溶液，作為線性對(duì)照品溶液。分別取溶液5、10、20、30和40 μl依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。頭孢噻肟回歸方程為：Y=1 357.2X+5.215 2(r=1)，線性范圍為0.516～4.124 μg。他唑巴坦回歸方程：Y= 883.65X+ 0.973 2(r=1)，線性范圍為0.083～0.663 μg。

1.他唑巴坦 2.頭孢噻肟

2.5 定量限 取頭孢噻肟對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml約含頭孢噻肟100 μ g的溶液，逐級(jí)稀釋，進(jìn)行測(cè)定，按信噪比10∶1，確定頭孢噻肟的最小定量限為0.11 ng。取他唑巴坦對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml約含他唑巴坦17 μ g的溶液，逐級(jí)稀釋，進(jìn)行測(cè)定，按信噪比10∶1，確定他唑巴坦的最小定量限為0.23 ng。

2.6 精密度試驗(yàn) 取線性試驗(yàn)項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，精密量取20 μl依次注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，頭孢噻肟和他唑巴坦峰面積的RSD分別為0.06%和1.04%。試驗(yàn)結(jié)果表明，本法進(jìn)樣精密度良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)20140401)，加流動(dòng)相制成每1 ml含頭孢噻肟100 μg、他唑巴坦17 μg的溶液，作為供試品溶液，置于溫度為5 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器上，分別于0、2、4、6、8、10和12 h進(jìn)樣測(cè)定。頭孢噻肟和他唑巴坦峰面積RSD分別為0.53%和0.44%，表明供試品溶液在5 ℃條件下12 h 內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)20140401)適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并制成每1 ml含頭孢噻肟100 μg、他唑巴坦17 μg的溶液，作為供試品溶液，共配制6份，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果按無(wú)水物計(jì)，頭孢噻肟和他唑巴坦標(biāo)示量的含量分別為101.4%和102.1%，RSD分別為0.38%和0.49%。

2.9 回收率試驗(yàn) 按照供試品溶液80%、100%、120%的濃度配制高、中、低三個(gè)樣品溶液，每個(gè)溶液配制三份，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1和表2。頭孢噻肟和他唑巴坦的平均回收率分別為100.6%和100.4%，RSD分別為0.79%和0.94%。

表1 頭孢噻肟回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 他唑巴坦回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.10 耐用性試驗(yàn) 分別考查了鹽用量、柱溫、流速、pH值、四丁基氫氧化銨用量、流動(dòng)相比例和波長(zhǎng)在±5%范圍內(nèi)變化，及采用不同的色譜柱對(duì)本品的含量測(cè)定的影響。上述不同條件下，頭孢噻肟和他唑巴坦的平均含量分別為100.7%和101.6%，RSD(n=15)分別為0.77%和0.82%。表明本法耐用性良好，微調(diào)鹽用量、柱溫、流速、pH值、四丁基氫氧化銨用量、流動(dòng)相比例和波長(zhǎng)，及更換不同廠家的色譜柱，對(duì)本品含量測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

2.11 含量測(cè)定 取注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉(6∶1)三批(批號(hào)20140401、20140402、20140403)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定頭孢噻肟和他唑巴坦的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

頭孢噻肟和他唑巴坦都是穩(wěn)定性較差的內(nèi)酰胺類化合物，在生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸和使用過(guò)程中易產(chǎn)生較多的雜質(zhì)，會(huì)干擾頭孢噻肟和他唑巴坦的含量測(cè)定，且在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)磷酸鹽的離子濃度和四丁基氫氧化銨的濃度對(duì)頭孢噻肟的保留時(shí)間、理論板數(shù)和峰型都有很大的影響。本文參考《中國(guó)藥典》他唑巴坦的含量測(cè)定方法進(jìn)行色譜條件的摸索[5]，采用Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液-10% 四丁基氫氧化銨溶液(190∶795∶15)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0)；流速為1.0 ml/min；波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果頭孢噻肟保留時(shí)間為29.245 min，理論板數(shù)為1 285；頭孢噻肟峰較寬，且出現(xiàn)肩峰，峰型很差，柱效低。隨后稍微增加磷酸二氫鉀的量，減少四丁基氫氧化銨的量，采用報(bào)道中的色譜條件，得到了較為滿意的分離效果：頭孢噻肟峰和他唑巴坦峰在10 min全部洗脫出來(lái)，兩個(gè)主峰之間、兩個(gè)主峰和雜質(zhì)之間都達(dá)到了基線分離。

在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，因?yàn)橐瑫r(shí)測(cè)定頭孢噻肟和他唑巴坦的含量，檢測(cè)波長(zhǎng)需要滿足兩個(gè)成分均有吸收的條件。本文分別取頭孢噻肟對(duì)照品、他唑巴坦對(duì)照品適量，加流動(dòng)相配制成50 μg/ml的溶液，照紫外分光光度法，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，頭孢噻肟的最大吸收波長(zhǎng)為254 nm，由于他唑巴坦在254 nm處無(wú)吸收，故選擇頭孢噻肟和他唑巴坦吸收均較強(qiáng)的220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，能夠同時(shí)測(cè)定本品中頭孢噻肟和他唑巴坦的含量。

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2 梅亞寧，童明慶. 2010年度衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)告：青壯年來(lái)源菌株耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012，22(1)：44-49

3 梅亞寧，童明慶.2011年度衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)告：成年患者分離菌的耐藥監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2014，30(2)：94-99

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5 中國(guó)藥典[S].二部.2010:169-170

Determination of cefotaxime sodium and tazobactam sodium in injection

Chen Aiping, Zhu Xueping, Dai Yunzhi

(Nanjin Yoko bio-Pharmaceutical co ltd，Nanjing 210029 )

Objective： To establish a new method for quantitative determination of cefotaxime and and tazobactam simultaneously in the injection preparation with cefotaxime sodium and tazobactam sodium at a ratio of 6 to 1. Methods： An RP-HPLC method was adopted. The analysis was performed on Agilent Eclipse Plus C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with a mobile phase consisting of methanol-potassium dihydrogen phosphate buffer (6.7 g potassium dihydrogen phosphate dissolved in water with 3ml of phosphoric acid and 2ml of butyl ammonium hydroxide and diluted to 1 000 ml) (27∶73).The flow rate of of the mobil phase was 1.0 ml/min. The detection wavelength was set at 220nm; and column temperature was 30 ℃；Injection volume was 20ul. Results： Cefotaxime and tazobactam were well-separated with resolution of 7.89. Cefotaxime and tazobactam was also separated from other impurities. The linear range of cefotaxime and tazobactam were 0.516～4.124 μg and 0.083～0.663 μg(r=1) respectively with RSD less than 1.04%; LOQs were 0.11 ng and 0.23 ng, respectively; The average recoveries of cefotaxime and tazobactam were 100.6% (RSD was 0.79%,n=9) and 100.4%( RSD was 0.94%,n=9),respectively. Conclusions： This method was proved to be simple, specific, accurate, and can be used to simultaneous determination of cefotaxime and tazobactam in cefotaxime sodium and tazobactam sodium (6∶1) for injection.

high performance liquid chromatography (HPLC)， cefotaxime，tazobactam，content determination

2016-07-19

R927.2

A

1006-5687(2016)05-0023-03