鹽酸沙格雷酯片微生物限度檢查方法的建立

張文燕，曹曉云

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

藥品質(zhì)量與檢驗(yàn)

鹽酸沙格雷酯片微生物限度檢查方法的建立

張文燕，曹曉云

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

目的：建立鹽酸沙格雷酯片的微生物限度檢查方法。方法：采用帶過(guò)濾功能均質(zhì)袋對(duì)樣品進(jìn)行粗濾，取粗濾后的供試溶液采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行計(jì)數(shù)檢查，采用未經(jīng)粗濾處理的供試液常規(guī)薄膜過(guò)濾法進(jìn)行控制菌檢查。結(jié)果：該方法的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)及控制菌檢查適用性試驗(yàn)均符合《中國(guó)藥典》2015年版的要求。結(jié)論：該法可用于鹽酸沙格雷酯片微生物限度需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)及控制菌檢查。

鹽酸沙格雷酯片，微生物限度檢查，樣品粗濾，薄膜過(guò)濾法

鹽酸沙格雷酯片是口服固體給藥制劑，主要作用是改善慢性動(dòng)脈閉塞癥所引起的潰瘍、疼痛以及冷感等缺血性諸癥狀。本品有一定的抑菌作用。執(zhí)行2010年版[2]時(shí)用500 r/min離心3 min，去除藥渣消除抑菌作用，取上清液以常規(guī)薄膜過(guò)濾法進(jìn)行微生物限度檢查。和《中國(guó)藥典》2010年版微生物限度檢查方法相比，2015年版[1]有重大增修訂，如取消了500 r/min離心3 min處理的方法，這對(duì)于原采用此方法去除藥渣，進(jìn)而消除抑菌成分的品種的微生物限度檢查帶來(lái)了挑戰(zhàn)，對(duì)檢查方法的建立帶來(lái)一定的困難。本文嘗試采用帶過(guò)濾功能均質(zhì)袋對(duì)樣品進(jìn)行粗濾，取粗濾后的供試液，采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行鹽酸沙格雷酯片的微生物限度檢查，并按照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則的要求進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，同時(shí)指出新版微生物限度檢查法進(jìn)行日常檢測(cè)時(shí)所需注意的問(wèn)題，旨在為檢測(cè)機(jī)構(gòu)和藥品生產(chǎn)廠家提供參考，為《中國(guó)藥典》2015 年版的順利實(shí)施提供參考[5]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BD240 恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)BINDER)；SG-403A TX-INT生物安全柜(美國(guó)Baker)；SQP 精密電子天平(德國(guó)賽多利斯)；Lab dancer 漩渦混合器(德國(guó)IKA)；Yamato 810C 高壓滅菌鍋(日本Yamato株式會(huì)社)；SHAKE4000-8CE搖床 (美國(guó)Thermo)；薄膜過(guò)濾器(英國(guó)Whatman公司)；帶過(guò)濾功能均質(zhì)袋(上新牌，過(guò)濾網(wǎng)孔徑<50 μm，規(guī)格30 cm×19 cm)；AESAP1069拍打儀(法國(guó)梅里埃)。

1.2 試驗(yàn)菌種 金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus,CMCC (B)26003]，枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis,CMCC(B)63501]，銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa,CMCC(B)10104]，白色念珠菌[Candida albicans,CMCC (F) 98001]，黑曲霉[Aspergillus niger,CMCC (F)98003]，大腸埃希菌[Escherichia coli，CMCC(B) 44102]均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào) 151202)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào) 151027)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào) 151106)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào) 151204)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào) 151124)均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào) 1404112)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。以上市售脫水培養(yǎng)基均按標(biāo)簽說(shuō)明配制并高壓滅菌后備用。

1.4 試驗(yàn)藥品 鹽酸沙格雷酯片(某公司生產(chǎn)，規(guī)格為100 mg/片，批號(hào)150401) 。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物接種至10 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32.5 ℃培養(yǎng)24 h；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，22.5 ℃培養(yǎng)72 h。取上述四種菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)基約25 ml，試管內(nèi)徑為25 mm)中，22.5 ℃培養(yǎng)7 d后，加入4 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80 的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

2.2 供試液制備 取本品10 g至無(wú)菌三角瓶中，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，振搖使分散均勻，作為1∶10的供試液。取1∶10供試液20 ml，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，制成1∶50供試液。以上各供試液分別平行制備6份。

2.3 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 比值計(jì)算 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過(guò)濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)[1,3,4]。公式1：試驗(yàn)組的比值=(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù))/菌液對(duì)照組的平均菌落數(shù)[1];公式2：粗濾處理后菌液組比值=粗濾處理后的平均菌落數(shù)/菌液對(duì)照組的平均菌落數(shù)。

2.3.2 1∶10和1∶50供試液平皿傾注法測(cè)定[1]

2.3.2.1 試驗(yàn)組 A：取1∶10供試液9.9 ml置滅菌試管中，加入適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml注皿，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置32.5 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～120 h，逐日觀察結(jié)果。同法制備含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的供試液。B：取1∶50供試液9.9 ml置滅菌試管中，后同A法。

2.3.2.2 供試品對(duì)照組 取1∶10和1∶50供試液各1 ml注皿，后同“2.3.2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)組A法。

2.3.2.3 菌液對(duì)照組 取適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至10 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml注皿，后同“2.3.2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)組A法。

2.3.2.4 結(jié)果 因本品抑菌性很強(qiáng)，各試驗(yàn)組的比值均為0，因此不能采用上述方法進(jìn)行本品微生物限度計(jì)數(shù)檢查。

2.3.3 1∶10和1∶50供試液薄膜過(guò)濾法測(cè)定[1]

2.3.3.1 試驗(yàn)組 A：取1∶10供試液9.9 ml置滅菌試管中，加入適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分次沖洗，取膜貼于相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上,置32.5 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～120 h，逐日觀察結(jié)果。同法制備含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的供試液。B：取1∶50供試液9.9 ml置滅菌試管中，后同A法。

2.3.3.2 供試品對(duì)照組 取1∶10和1∶50供試液各1ml薄膜過(guò)濾，后同“2.3.3.1”項(xiàng)下試驗(yàn)組A法。

2.3.3.3 菌液對(duì)照組 取適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至10 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml薄膜過(guò)濾，后同“2.3.3.1”項(xiàng)下試驗(yàn)組A法。

2.3.3.4 結(jié)果 按“2.3.1”項(xiàng)下公式1計(jì)算比值，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表1結(jié)果，常規(guī)1∶10供試液1 ml薄膜過(guò)濾，由于本品藥渣的影響，在薄膜上無(wú)法正常計(jì)數(shù)，因此不能采取本方法進(jìn)行計(jì)數(shù)試驗(yàn)。常規(guī)1∶50供試液1 ml薄膜過(guò)濾，雖然藥渣影響減弱，但對(duì)菌落計(jì)數(shù)的影響依然存在，尤其是枯草芽孢桿菌和銅綠假單孢菌，因此不能采取本方法進(jìn)行計(jì)數(shù)試驗(yàn)。

表1 1∶50供試液薄膜過(guò)濾法測(cè)定試驗(yàn)組比值

2.3.4 粗濾處理1∶10和1∶50供試液薄膜過(guò)濾法測(cè)定

2.3.4.1 試驗(yàn)組 A：將三角瓶中1∶10供試液100 ml中，加入適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，將該供試液全量置于帶過(guò)濾功能均質(zhì)器專用袋大體積一側(cè)中，在拍打儀中充分拍打30 s。取過(guò)濾后小體積一側(cè)的試液1 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分次沖洗，取膜貼于相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上，置32.5 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～120 h，逐日觀察結(jié)果。同法制備含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的供試液。B：將三角瓶中1∶50供試液100 ml中，加入適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，將該供試液全量置于帶過(guò)濾功能均質(zhì)器專用袋大體積一側(cè)中，在拍打儀中充分拍打30 s。取過(guò)濾后小體積一側(cè)的試液1ml薄膜過(guò)濾，后同試驗(yàn)組A法。

2.3.4.2 供試品對(duì)照組 取1∶10和1∶50供試液分別全量置于帶過(guò)濾功能均質(zhì)器專用袋大體積一側(cè)中，在拍打儀中充分拍打30 s。取過(guò)濾后小體積一側(cè)的試液各1 ml薄膜過(guò)濾，后同“2.3.4.1”項(xiàng)下試驗(yàn)組A法。

2.3.4.3 菌液對(duì)照組 取適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml薄膜過(guò)濾，后同“2.3.4.1”項(xiàng)下試驗(yàn)組A法。

2.3.4.4 粗濾處理后菌液對(duì)照組 取適量濃度的0.1 ml枯草芽孢桿菌菌液加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，將該供試液全量置于帶過(guò)濾功能均質(zhì)器專用袋大體積一側(cè)中，在拍打儀中充分拍打30 s。取過(guò)濾后小體積一側(cè)的試液1 ml薄膜過(guò)濾，后同“2.3.4.1”項(xiàng)下A法。

2.3.4.5 結(jié)果 按“2.3.1”項(xiàng)下公式1和公式2計(jì)算比值，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。根據(jù)表2結(jié)果可以看出，帶過(guò)濾功能的均質(zhì)器專用袋對(duì)樣品進(jìn)行粗濾處理后菌液對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值在0.5～2之間，是符合《中國(guó)藥典》規(guī)定的。因此，本品可以采用上述粗濾的方法進(jìn)行供試液的處理。從表3可以看出，粗濾處理后的1∶10供試液1 ml進(jìn)行薄膜過(guò)濾，雖然藥渣影響減弱，但對(duì)菌落計(jì)數(shù)的影響依然存在，尤其是枯草芽孢桿菌和銅綠假單孢菌，而且由于藥渣的殘留，本品對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌作用依然存在，所以不能采用此方法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。粗濾處理后1∶50供試液1 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分5次進(jìn)行沖洗，結(jié)果試驗(yàn)組菌數(shù)與菌液對(duì)照組菌數(shù)的比值均在0.5～2之間，因此，鹽酸沙格雷酯片微生物限度需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查可采用此法。

表2 粗濾處理后菌液對(duì)照組回收率比值(n=3)

2.4 控制菌方法適用性試驗(yàn) 鹽酸沙格雷酯片為口服固體制劑，控制菌檢查大腸埃希菌。在之前按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄[2]進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)候，采用的方法為：取本品10 g，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶10供試液。取1∶10供試液適量，置離心管中，以500 r/min離心3 min后，取全部上清液10 ml，薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分次沖洗，在最后一次沖洗液中加入規(guī)定量大腸埃希菌(約10～100 cfu)后過(guò)濾，取濾膜加入到500 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。因此，嘗試新的方法進(jìn)行控制菌檢查法的方法適用性試驗(yàn)。

2.4.1 供試液制備 同“2.2”項(xiàng)下供試液制備。

2.4.2 菌液制備 取大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32.5 ℃培養(yǎng)24 h。取上述大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液。2.4.3 方法適用性試驗(yàn) 曾嘗試取1∶10的供試液10 ml薄膜過(guò)濾，因藥渣殘留太多，根本無(wú)法過(guò)濾下去，因此采用分兩張濾膜過(guò)濾，每膜5 ml，加入規(guī)定量試驗(yàn)菌(不大于100 cfu)，取兩濾膜置500 ml和800 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，試驗(yàn)組均未有菌落生長(zhǎng)。因此不能采用上述方法進(jìn)行檢查。①試驗(yàn)組：取1∶10的供試液10 ml薄膜過(guò)濾，分兩張濾膜過(guò)濾，每膜5 ml，加入規(guī)定量試驗(yàn)菌(不大于100 cfu)，取兩濾膜置1 000 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法檢查。②陽(yáng)性對(duì)照組：取規(guī)定量大腸埃希菌(不大于100 cfu)，加入1 000 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32.5 ℃培養(yǎng)18 h。③陰性對(duì)照組：取10 ml pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液同試驗(yàn)組操作。取試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組上述培養(yǎng)物各1 ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，43 ℃培養(yǎng)24 h。取上述麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上， 32.5 ℃培養(yǎng)18 h。陽(yáng)性對(duì)照組平板上菌落形態(tài)為鮮桃紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。試驗(yàn)組上菌落形態(tài)與陽(yáng)性對(duì)照組一致。陽(yáng)性對(duì)照組麥康凱瓊脂平板上有大腸埃希菌生長(zhǎng)；試驗(yàn)組麥康凱瓊脂平板上有大腸埃希菌生長(zhǎng)。陰性對(duì)照組無(wú)菌落生長(zhǎng)。見(jiàn)表4。

2.4.4 結(jié)果 從表4可以看出，陰性對(duì)照組未檢出試驗(yàn)菌，試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，因此鹽酸沙格雷酯片控制菌檢查可以采用薄膜過(guò)濾法。取本品10 g，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶10供試液。取1∶10的供試液10 ml薄膜過(guò)濾，分兩張濾膜過(guò)濾，每膜5 ml，加入規(guī)定量試驗(yàn)菌(不大于100 cfu)，取兩濾膜置1 000 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法檢查。

表3 粗濾處理后1∶10和1∶50供試液薄膜過(guò)濾法測(cè)定試驗(yàn)組比值(n=3)

表4 控制菌檢查法方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

注：“+”表示液體培養(yǎng)基變渾濁，或分離平板上有菌落生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)特征與相應(yīng)目標(biāo)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株一致。“-”表示液體培養(yǎng)基澄清，或分離平板上無(wú)菌生長(zhǎng)，或有菌生長(zhǎng)但生長(zhǎng)特征與相應(yīng)目標(biāo)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株不一致。 “/”表示空白。

3 討論

3.1 通過(guò)上述方法摸索，成功建立了鹽酸沙格雷酯片的微生物限度檢查方法?！吨袊?guó)藥典》2015年版將500 r/min離心3 min處理供試液的方法取消，這是出于“需氧菌總數(shù)”計(jì)數(shù)里包含霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)的考慮，因?yàn)槊咕徒湍妇w較細(xì)菌重量大，在離心的過(guò)程中，會(huì)隨著藥渣離心到下部分，若藥品被這些菌污染，則檢驗(yàn)結(jié)果并不能完全真實(shí)反映藥品的污染情況，對(duì)患者的使用帶來(lái)了潛在的安全隱患。這個(gè)供試液處理方法的取消，對(duì)于本身具有抑菌性的口服固體，尤其是含有藥渣的藥品的微生物限度檢查方法的建立帶來(lái)了一定的困難。本課題采用帶過(guò)濾功能的均質(zhì)袋進(jìn)行粗濾，可以截留一部分顆粒比較大的藥渣，減少試驗(yàn)中薄膜上藥渣殘留過(guò)多導(dǎo)致無(wú)法沖洗或者藥渣殘留過(guò)多導(dǎo)致薄膜上無(wú)法計(jì)數(shù)的問(wèn)題，以及藥渣的殘留導(dǎo)致藥品的抑菌性無(wú)法消除，從而試驗(yàn)菌的回收率無(wú)法達(dá)到《中國(guó)藥典》要求的困局。

3.2 《中國(guó)藥典》2015年版方法接種和稀釋的步驟中，將供試液和試驗(yàn)菌混勻后，再加入到平皿中或者進(jìn)行薄膜過(guò)濾的操作。這樣的操作更能真實(shí)的反映藥品被微生物污染的情況。

3.3 根據(jù)實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，在接種和稀釋的步驟中，供試液和菌液的混合時(shí)間不宜太短，應(yīng)至少混合5～10 min之上，保證藥品和試驗(yàn)菌的充分混合，以及試驗(yàn)更好的重復(fù)性，更真實(shí)地模擬藥品被微生物污染的情況。

3.4 方法適用性試驗(yàn)表明，鹽酸沙格雷酯片的微生物限度方法為：取本品10 g至無(wú)菌三角瓶中，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，振搖使分散均勻，作為1∶10的供試液。取1∶10供試液20 ml，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，制成1∶50供試液。將三角瓶中1∶50供試液全量置于帶過(guò)濾功能均質(zhì)器專用袋大體積一側(cè)中，在拍打儀中充分拍打30 s。取過(guò)濾后小體積一側(cè)的試液作為粗濾1∶50供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)試驗(yàn)。取粗濾1∶50供試液1 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分5次進(jìn)行沖洗，取濾膜貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，依法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查。取1∶10供試液10 ml薄膜過(guò)濾，分兩張濾膜過(guò)濾，每膜5 ml，取兩濾膜置1 000 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法進(jìn)行大腸埃希菌檢查。

1 中國(guó)藥典[S]. 四部.2015：140-151

2 中國(guó)藥典[S]. 二部.2010：附錄107-116

3 美國(guó)藥典[S]. 38 版. 2015：106-120

4 歐洲藥典[S]. 8.0版．2014：185-194

5 李趣嫦，江艷芳.《中國(guó)藥典》2010版與2015版微生物限度檢查法對(duì)四種藥物檢測(cè)結(jié)果的比較[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2015，16(2):86-90

2016-07-22

R927.11

A

1006-5687(2016)05-0014-04