呼出氣冷凝液中LTB4和CCL11水平與兒童哮喘分期的研究

李莉，丁俊麗，榮杰鑫，李遠波，王亞亭

（1.安徽醫(yī)科大學 研究生院，安徽 合肥 230031；2.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 兒科，安徽 合肥 230031）

呼出氣冷凝液中LTB4和CCL11水平與兒童哮喘分期的研究

李莉1，丁俊麗2，榮杰鑫1，李遠波1，王亞亭2

（1.安徽醫(yī)科大學 研究生院，安徽 合肥 230031；2.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 兒科，安徽 合肥 230031）

目的探索呼出氣冷凝液（EBC）中白三烯B4（LTB4）和嗜酸性粒細胞趨化因子（CCL11）2種標記物對兒童哮喘病情的評估作用。方法收集64例哮喘患兒。其中，急性發(fā)作期33例，慢性持續(xù)期18例，緩解期13例，選同時期8例健康兒童作對照組。采用R-Tube收集每個實驗對象的EBC，酶聯(lián)免疫吸附法檢測每個標本中LTB4和CCL11。結果①EBC中LTB4水平從高到低依次為發(fā)作組（70.89±8.31）pg/ml、持續(xù)組（35.27±6.61）pg/ml、緩解組（24.58±4.90）pg/ml、對照組（15.53±3.24）pg/ml，各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；②EBC中CCL11水平最高為哮喘發(fā)作組（3.38±0.65）pg/ml，其次為持續(xù)組（2.46±0.52）pg/ml、緩解組（0.90±0.36）pg/ml和對照組（0.71±0.26）pg/ml，緩解組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。結論EBC中LTB4、CCL11水平能反映哮喘氣道炎癥及其控制情況，對哮喘患兒病情的評估有一定價值。

兒童；支氣管哮喘；呼出氣冷凝液；白三烯B4；嗜酸性粒細胞趨化因子

哮喘是由多種細胞及多種細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥。白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）是目前已知最強的中性粒細胞趨化因子和活化因子之一[1]。嗜酸性粒細胞趨化因子（Eotaxin，CCL11）對嗜酸性粒細胞的趨化具有高度特異性，且對于抗原誘導的嗜酸性粒細胞在肺部組織的募集機制中起主要作用[2]。

近些年來新興的呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）檢測，與傳統(tǒng)氣道評價方法相比具有操作方便、無創(chuàng)、無不適、可多次重復等優(yōu)點。本研究旨通過檢測所有受試者EBC中LTB4和CCL11的水平，分析這2種標志物與哮喘分期是否相關。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月-2016年6月因哮喘就診于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院門診的64例患兒，納入患兒符合[3]哮喘診斷標準。根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)分為3組：急性發(fā)作期（發(fā)作組）33例，男性21例，女性12例，年齡（6.90±2.78）歲；慢性持續(xù)期（持續(xù)組）18例，男性14例，女性4例，年齡（6.85±2.80）歲；緩解期（緩解組）13例，男性10例，女性3例，年齡（9.91±3.92）歲。收集同期在門診體檢的健康兒童8例作為對照組，男性4例，女性4例，年齡（8.05± 3.15）歲。所有受試對象無其他慢性心肺疾患、實驗前1周內無呼吸道感染、未口服或吸入糖皮質激素、未使用抗白三烯藥物。各組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義。實驗均通過受試者家屬的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 EBC標本收集 EBC標本的收集使用美國Respiratory Research公司生產的R-Tube管。收集前，將鋁制的冷卻套筒裝在1個真空包裝袋中，包裝好置入-86℃冰箱冷凍保存，使之充分冷卻。使用時將絕緣保護套套在冷卻好的冷凝套筒外面，再將R-Tube采集管套入冷凝套筒里面。然后用鼻夾夾住患者鼻子，囑其通過R-Tube上的口含器平靜呼吸。持續(xù)5～10 min。吸氣時管中單向閥門關閉，空氣不能進入采集管。呼氣時單向閥門打開，引導呼出的氣流進入采集管，穿過冷凝套筒，收集EBC。將收集到的EBC標記后置入-86℃冰箱冷凍保存?zhèn)錂z。

1.2.2 標本檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinked immunoadsordent assay，ELISA） 對 EBC中LTB4和CCL11進行檢測。2種ELISA試劑盒均采購于英國的Abcam公司（LTB4的敏感性為5.63 pg/ml，檢測范圍11.7～3 000.0 pg/ml；CCL11的敏感性為0.41 pg/ml，檢測范圍0.41～300.00 pg/ml）。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EBC中LTB4水平與哮喘分期的關系

發(fā)作組EBC中LTB4的為（70.89±8.31）pg/ml，持續(xù)組為（35.27±6.61）pg/ml，緩解組為（24.58± 4.90）pg/ml，對照組為（15.53±3.24）pg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=244.570，P=0.000）。

2.2 EBC中CCL11水平與哮喘分期的關系

發(fā)作組EBC中CCL11的為（3.38±0.65）pg/ml，持續(xù)組為（2.46±0.52）pg/ml，緩解組為（0.90± 0.36）pg/ml，對照組為（0.71±0.26）pg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=89.748，P=0.000）。

3 討論

哮喘是以氣道炎癥為特征的異質性疾病，具有喘息、氣促、胸悶和咳嗽的呼吸道癥狀，伴可變的呼氣氣流受限。大多數(shù)患兒臨床癥狀較輕。醫(yī)生根據(jù)典型癥狀易于診斷和治療。然而對于不典型哮喘，或哮喘發(fā)病的早期診斷困難，治療時難以根據(jù)哮喘的臨床或炎癥表型設計個性化的治療方案，且有時一些合并癥會影響哮喘的診斷及治療。目前，治療方案的制定主要依據(jù)臨床表現(xiàn)及癥狀和肺功能。該方法并非對哮喘患兒均有效。最近研究表明，不同表型的哮喘即使臨床癥狀相似，對應的下呼吸道炎癥的表現(xiàn)也是不盡相同的[4-5]。以往學者多通過肺活檢或肺泡灌洗液檢測來了解哮喘氣道的炎癥，然后根據(jù)檢測結果，針對不同的發(fā)病機制及不同哮喘表型制定相應的治療方案，被驗證是有效的[6-8]。但上述方法因為會對患者造成創(chuàng)傷或帶來不適，不能用于兒童哮喘的日常監(jiān)測?？茖W家們開始尋找無創(chuàng)的檢測方法分析炎癥標志物，定義炎癥表型，如誘導痰、尿液和呼出氣冷凝液的檢測。誘導痰檢測結果易受口腔影響，可引起氣道痙攣，造成危險，且兒童呼吸道粘膜鮮嫩，不易短期內重復操作。尿液中含有的哮喘標記物有限，且標志物對哮喘炎癥的真實反映有待進一步證實。近年來新興的EBC的檢測具有無創(chuàng)、安全及可重復性好，EBC直接來自于呼吸道，結果可靠，且檢測操作并不會影響到疾病過程等優(yōu)點，被國內外越來越多學者重視。

傳統(tǒng)認為，痰嗜酸性粒細胞增多是哮喘氣道炎癥的特征之一，但近年發(fā)現(xiàn)部分患者未升高，而是以中性粒細胞浸潤為主的氣道炎癥，甚至在哮喘惡化和持續(xù)期，升高的也是中性粒細胞[9]。LTB4是已知活性最強的中性粒細胞趨化因子和化學動力物質，是參與哮喘氣道炎癥的重要炎癥介質。LTB4主要來源于活化的巨噬細胞、中性粒細胞、血小和肥大細胞，呼吸道上皮細胞在炎癥反應中亦可生成少量的LTB4。LTB4有2種G蛋白偶聯(lián)受體，分別是高親和力人白三烯B4受體1和低親和力人白三烯B4受體2。有研究表明，LTB4是通過人白三烯B4受體1引起的哮喘[10]。本研究結果顯示，發(fā)作組哮喘患兒EBC中LTB4水平高于其他組，支持LTB4參與哮喘發(fā)病的說法，并可成功將急性發(fā)作期與其他各期區(qū)分。持續(xù)組患兒EBC中LTB4水平低于發(fā)作組，高于緩解組，說明哮喘急性發(fā)作后氣道內LTB4水平有所恢復，但恢復緩慢，需要一定的過程。緩解組患兒EBC中LTB4水平高于對照組，說明即使經(jīng)典的吸入激素治療哮喘使臨床癥狀緩解，氣道內炎癥仍在持續(xù)。如果有藥物可降低氣道內LTB4的水平，將會是很好的哮喘治療藥物。最近就有研究報道，齊留通可抑制5-脂氧化酶而抑制LTA4的合成，進而抑制體內的半胱氨酰白三烯及LTB4的合成，在哮喘治療中發(fā)揮積極作用[11]。這為哮喘的治療提供新的思路。

嗜酸性粒細胞是體內參與哮喘及其他過敏性疾病的主要效應細胞。在支氣管哮喘的發(fā)生過程中，嗜酸性粒細胞可從外周血中趨化至肺部，隨后進一步釋放炎癥介質如花生四烯酸代謝物、氧自由基、細胞因子/趨化因子及細胞毒性顆粒蛋白等物質。CCL11在抗原誘導的嗜酸性粒細胞在肺部組織的募集中起主要作用。且CCL11對嗜酸性粒細胞的趨化具有高度特異性，只能特異性地與嗜酸性粒細胞上大量存在的CCR3受體結合，且有高度親和性。王濤等[12]研究證實，CCL11與受體CCR3的結合引發(fā)的炎癥在在哮喘病理生理機制中的發(fā)揮重要作用。ZIETKOWSKI等[13]將患兒EBC中CCL11的檢測與運動激發(fā)試驗相結合。發(fā)現(xiàn)CCL11可通過對嗜酸性粒細胞在肺部的遷移和提高嗜酸性粒細胞的活性進而增強和延長運動激發(fā)試驗的效果。本研究發(fā)作組EBC中CCL11水平最高，更驗證在受到刺激后，哮喘患兒氣道內CCL11的生成增加促進哮喘急性發(fā)作，與ZIETK-OWSKI等的研究相似。在ZIETKOWSKI等[14]的研究中經(jīng)吸入激素治療后的緩解的哮喘患兒EBC中CCL11高于對照組。本研究中緩解組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。原因有待進一步探究。有研究報道，經(jīng)奧馬珠單抗（抗免疫球蛋白E單克隆抗體）治療16周后，哮喘患兒EBC中CCL11水平下降，與呼出氣NO，血清嗜酸性粒細胞陽離子蛋白，外周血中嗜酸性粒細胞計數(shù)的下降相關[15]。這為哮喘的治療提供可能的新的思路。

綜上所述，通過對EBC中LTB4和CCL11的檢測，驗證2種炎癥介質在哮喘發(fā)病機制中的重要作用。EBC中LTB4的檢測哮喘患兒的各個分期的結果差異有統(tǒng)計學意義，EBC中CCL11的檢測結果除緩解期，在急性發(fā)作期和慢性持續(xù)期比較，差異有統(tǒng)計學意義。這種檢測方法對兒童哮喘的診斷及日?？刂频谋O(jiān)測有潛在的應用價值，但兒童哮喘的各個分期時EBC中2種物質的具體取值范圍還需要更多的研究確定，所以離臨床的實際應用還有一定的距離。同時本實驗的研究結果也為兒童哮喘的臨床治療提供可能的創(chuàng)新治療方法。

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（李科 編輯）

Role of LTB4 and CCL11 levels of exhaled breath condensate in assessment of asthma in children

Li Li1,Jun-li Ding2,Jie-xin Rong1,Yuan-bo Li1,Ya-ting Wang2
(1.Graduate School,Anhui Medical University,Hefei,Anhui 230031,China;2.Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei,Anhui 230031,China)

ObjectiveTo investigate effect of leukotriene B4 (LTB4)and eotaxin (CCL11)in exhaled breath condensate (EBC)on the evaluation of asthma in children.MethodsSixty-four children with asthma were enrolled,including 33 with acute asthma exacerbation,18 with chronic asthma and 13 with asthma remission;and 8 healthy children were enrolled as controls.The EBC of each subject was collected using RTube.LTB4 and CCL11 were detected by ELISA in each sample.ResultsThe LTB4 levels of EBC in the order from high to low were the acute asthma exacerbation group [(70.89±8.31)pg/ml],the chronic asthma group[(35.27±6.61)pg/ml],the asthma remission group[(24.58±4.90 pg/ml)],and the control group[(15.53± 3.24 pg/ml)];there were significant differences among the groups(P<0.05).The CCL11 level of EBC was the highest in the acute asthma exacerbation group [(3.38±0.65)pg/ml],followed by the chronic asthma group [(2.46±0.52)pg/ml],the asthma remission group[(0.90±0.36)pg/ml],and the control group[(0.71±0.26)pg/ ml];there was no significant difference between the asthma remission group and the control group (P>0.05).ConclusionsThe levels of LTB4 and CCL11 in EBC can reflect the status of airway inflammation in asthma and its control.They are valuable in assessment of the condition of children with asthma.

children;asthma;exhaled breath condensate;leukotriene B4;eotaxin

R725.6；R562.25

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.029

1005-8982（2017）09-0133-04

2016-11-01

王亞亭，E-mail：wangyating1348@126.com；Tel：13856946681