濾膜法和Pseudalert酶底物法檢測(cè)飲用水中銅綠假單胞菌的比較

王莉莉

（廣西綠城水務(wù)股份有限公司，廣西南寧 530031）

銅綠假單胞菌，又稱綠膿桿菌，是一種重要的水源和食源性條件致病菌，其分布廣泛，對(duì)消毒劑、紫外線等具有一定的耐受性且對(duì)不良環(huán)境抵抗力強(qiáng)，在常溫的水中可以存活數(shù)月。易感人群感染后，可能引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病，因此準(zhǔn)確檢測(cè)水中銅綠假單胞菌的情況尤為重要[1-2]。目前，銅綠假單胞菌國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016）[3]。該方法為濾膜法，檢測(cè)時(shí)間需要48 h，并且需要后續(xù)的確證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，過(guò)程煩瑣。而國(guó)際上，Pseudalert酶底物法檢測(cè)瓶裝水中銅綠假單胞菌已通過(guò)ISO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的認(rèn)證——《水質(zhì)銅綠假單胞菌的檢測(cè)和計(jì)數(shù)—最大可能數(shù)法》（ISO 16266-2：2018）[4]，可以在24 h內(nèi)定量或定性檢測(cè)水中銅綠假單胞菌，無(wú)需確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。本文利用傳統(tǒng)濾膜法和酶底物法，同時(shí)檢測(cè)定量質(zhì)控、實(shí)際水樣及水樣加標(biāo)中銅綠假單胞菌，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了分析比較，以期對(duì)酶底物法檢測(cè)水中銅綠假單胞菌的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，為飲用水的安全供應(yīng)提供更便捷的檢測(cè)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

4株銅綠假單胞菌（ATCC9027、ATCC27853、CMCC10104和CMCC15442）及4種陰性菌（熒光假單胞菌AS1.55、惡臭假單胞菌ATCC49128、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌）標(biāo)準(zhǔn)菌株，上海魯微科技有限公司；CN瓊脂培養(yǎng)基、乙酰胺肉湯、金氏B培養(yǎng)基等濾膜法材料，廣東環(huán)凱有限公司；Pseudalert酶底物試劑、無(wú)菌取樣瓶、97孔定量盤(pán)、NSI定量質(zhì)控菌株（產(chǎn)品批號(hào)為020419）等耗材，IDEXX公司。

DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司，溫控精度為±0.5 ℃，經(jīng)計(jì)量部門校準(zhǔn)合格。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水樣采集

水樣類型包括南寧市居民的龍頭水和管網(wǎng)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的管網(wǎng)水。參照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集和保存》（GB/T 5750.2—2006）[5]進(jìn)行采集和樣品保存，采樣容器使用一次性無(wú)菌含硫代硫酸鈉采樣瓶。水樣采集后冷藏保存，并在4 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 定量質(zhì)控檢測(cè)

NSI定量質(zhì)控菌株從-10 ℃冰箱取出，平衡溫度10～15 min后，將質(zhì)控菌株轉(zhuǎn)移入預(yù)先準(zhǔn)備好的100 mL無(wú)菌磷酸緩沖液中，輕輕振蕩，待全部溶解后在30 min內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 樣品檢測(cè)

樣品使用濾膜法和酶底物法進(jìn)行檢測(cè)，濾膜法檢測(cè)步驟參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016），培養(yǎng)溫度（36±1）℃，48 h，并根據(jù)菌落顏色和熒光產(chǎn)生情況進(jìn)行后續(xù)的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。Pseudalert酶底物法檢測(cè)步驟參照《水質(zhì)銅綠假單胞菌的檢測(cè)和計(jì)數(shù)—最大可能數(shù)法》（ISO 16266-2：2018），用IDEXX取樣瓶取樣，使用定性方法檢測(cè)，培養(yǎng)溫度為（38±0.5）℃，24 h。

1.2.4 水樣加標(biāo)

采用標(biāo)準(zhǔn)菌株，根據(jù)梯度稀釋，制作水樣加標(biāo)。

1.2.5 菌落總數(shù)檢測(cè)

采用《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》（GB/T 5750.12—2006）[6]中的方法對(duì)各個(gè)水樣品中異養(yǎng)菌進(jìn)行菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌定量質(zhì)控檢測(cè)

濾膜法和Pseudalert酶底物法對(duì)于銅綠假單胞菌定量質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明：兩種方法的檢測(cè)結(jié)果均在質(zhì)控樣結(jié)果的真值范圍內(nèi)，Pseudalert酶底物法可以準(zhǔn)確檢測(cè)銅綠假單胞菌定量質(zhì)控。

表1 兩種方法檢測(cè)NSI定量質(zhì)控樣品的結(jié)果

2.2 實(shí)際水樣和加標(biāo)水樣

2.2.1 對(duì)于龍頭水和管網(wǎng)水的檢測(cè)

按照標(biāo)準(zhǔn)采用濾膜法和Pseudalert酶底物法對(duì)50組龍頭水和管網(wǎng)水進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2.2 對(duì)于加標(biāo)水樣的檢測(cè)

濾膜法和Pseudalert酶底物法對(duì)于加標(biāo)水樣的檢測(cè)結(jié)果如表2所示，水樣中的菌落總數(shù)結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，濾膜法和Pseudalert酶底物法對(duì)于加標(biāo)水樣的檢測(cè)結(jié)果一致，Pseudalert酶底物法可以定性檢測(cè)低濃度至1 MPN/250 mL，檢測(cè)陽(yáng)性水樣準(zhǔn)確。

表3 菌落總數(shù)的檢測(cè)結(jié)果（單位：CFU/mL）

2.3 陰性菌檢測(cè)結(jié)果

Pseudalert試劑檢測(cè)4種陰性菌加標(biāo)水樣均為陰性，同時(shí)檢測(cè)的菌落總數(shù)可以反映抑制濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，Pseudalert酶底物法能有效抑制陰性菌，減少假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

表4 陰性菌的檢測(cè)結(jié)果（單位：CFU/mL）

3 結(jié)論

傳統(tǒng)濾膜法和Pseudalert酶底物法對(duì)于水中銅綠假單胞菌的檢測(cè)結(jié)果一致，傳統(tǒng)濾膜法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法，在全國(guó)范圍內(nèi)使用相對(duì)廣泛，需要多種培養(yǎng)基，配備無(wú)菌室，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，并且需要確證實(shí)驗(yàn)。Pseudalert酶底物法可以在24 h內(nèi)定量或定性檢測(cè)水中銅綠假單胞菌，相對(duì)于濾膜法，檢測(cè)成本提高，但優(yōu)勢(shì)明顯：無(wú)需確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，操作簡(jiǎn)單；對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)要求不高，可以減少人員之間的誤差及實(shí)驗(yàn)室工作量；定性檢測(cè)無(wú)需設(shè)備，適合野外及應(yīng)急檢測(cè)，為飲用水的安全供應(yīng)提供更便捷的保證。