3T3-L1脂肪細胞誘導分化的研究進展

劉 秀，劉新農(nóng)，李天佳，劉 暴

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京100730

·綜述·

3T3-L1脂肪細胞誘導分化的研究進展

劉 秀，劉新農(nóng)，李天佳，劉 暴

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京100730

隨著脂肪代謝性疾病的增多，有關(guān)脂肪細胞的體外研究成為近年來研究熱點。3T3-L1前脂肪細胞系是建立成熟脂肪細胞模型最為常用的細胞系之一，但經(jīng)典的脂肪細胞誘導方案存在轉(zhuǎn)化率低、轉(zhuǎn)化不均勻等問題。近年來，諸多學者通過改變誘導劑作用時間、增加新的誘導藥物等方法，即改良誘導法，進行脂肪細胞模型的建立。本文主要從傳統(tǒng)誘導法和改良誘導法兩方面，總結(jié)了3T3-L1脂肪細胞誘導分化的研究進展。

3T3-L1前脂肪細胞系；脂肪細胞模型；轉(zhuǎn)化率；傳統(tǒng)法；改良法

隨著人們生活水平的不斷提高，肥胖及其相關(guān)疾病的發(fā)病率逐年上升，由此而導致的家庭及社會負擔亦不斷加重。脂肪細胞代謝及功能異常是導致肥胖的核心機制之一[1- 2]。目前，有關(guān)脂肪細胞代謝及功能的研究已成為熱點。在體外實驗中，脂肪細胞是研究脂肪相關(guān)問題的基本工具。近年來，諸多改良誘導法的報道不斷增多，現(xiàn)就目前誘導方法及各自優(yōu)缺點做一綜述。

傳統(tǒng)誘導法

傳統(tǒng)誘導方法，即經(jīng)典“雞尾酒”誘導法，在3T3-L1前脂肪細胞融合培養(yǎng)48 h基礎上(基礎培養(yǎng)基Ⅰ)，將一定濃度的地塞米松、3-異丁基- 1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl- 1-methylxanthine，IBMX)、胰島素序貫加入3T3-L1前脂肪細胞培養(yǎng)液中(誘導劑Ⅰ)48 h后，更換為只含一定濃度胰島素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h(誘導劑Ⅱ)，之后用普通高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(基礎培養(yǎng)基Ⅱ)，每2 d換液，歷時約12～14 d，可將其成功誘導為成熟脂肪細胞[3]。試劑配制如下：(1)基礎培養(yǎng)基Ⅰ：高糖DMEM培養(yǎng)液、10%(體積分數(shù))小牛血清、1%青霉素和鏈霉素；(2)誘導劑Ⅰ：高糖DMEM培養(yǎng)液、10%(體積分數(shù))胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%青霉素和鏈霉素、胰島素(1 μg/ml)、地塞米松(0.25 μmol/L)、IBMX(0.5 mmol/L)；(3)誘導劑Ⅱ：高糖DMEM培養(yǎng)液、10%(體積分數(shù))FBS、1%青霉素和鏈霉素、胰島素(1 μg/ml)；(4)基礎培養(yǎng)基Ⅱ：高糖DMEM培養(yǎng)液、10%(體積分數(shù))FBS、1%青霉素和鏈霉素。

細胞系選擇1975年，Green等[4]報道小鼠的3T3細胞系是具有多項分化潛能的前體細胞系，屬于成纖維細胞系。并對其不同亞群進行研究比較，包括3T3-L1、3T3-M2。研究證實，在體外脂肪細胞模型的建立中，3T3-L1細胞系是轉(zhuǎn)化率最高、最具特性和最為穩(wěn)定的亞細胞系之一[4- 5]。3T3-L1在適當誘導條件下所誘導的脂肪細胞，無論是細胞形態(tài)還是生物性能都與體內(nèi)脂肪細胞相似，為體外脂肪細胞的實驗研究提供了可能。

接觸抑制加入誘導劑前的細胞間接觸抑制是脂肪細胞誘導過程中的關(guān)鍵。3T3-L1細胞本身并無脂肪細胞的特性，細胞在快速增殖期生長為成纖維細胞。但經(jīng)過接觸抑制后細胞間的自噬作用導致線粒體重構(gòu)[6]，同時激活胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor- 1，IGF- 1) 受體信號通路[7]，使其開始向脂肪細胞轉(zhuǎn)化，并不斷融合為脂滴。誘導劑的加入能夠加速其向脂肪細胞轉(zhuǎn)化的過程，但在沒有發(fā)生接觸抑制的細胞中即使加入誘導劑也不能使其轉(zhuǎn)化為脂肪細胞[8]。目前細胞接觸抑制時間并不統(tǒng)一，經(jīng)典的誘導方法接觸抑制時間為48 h，也有研究報道采用24 h[9]，因之后的誘導中另外加入了其研究的提取物質(zhì)，無法證明縮短接觸抑制時間對細胞轉(zhuǎn)化的影響。

誘導劑及其濃度在不添加任何誘導劑的情況下，細胞發(fā)生接觸抑制后約要2～4周才能轉(zhuǎn)化為脂肪細胞[8]。為加速其轉(zhuǎn)化過程，研究者嘗試加入不同的誘導劑：IBMX、皮質(zhì)激素、胰島素、維生素、吲哚美辛等。研究對比得出經(jīng)典的誘導劑：IBMX、地塞米松、胰島素。其分子機制分別為：IBMX，一種cAMP磷酸二酯酶抑制劑，能夠激活cAMP依賴性蛋白激酶途徑，促進過氧化物酶體增生物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白家族(CCAAT/enhancer-binding protein family，C/EBPs)的表達，激發(fā)3T3-L1向脂肪細胞轉(zhuǎn)化[10]；地塞米松，一種抗炎類固醇分子，通常用于激活糖皮質(zhì)激素受體途徑，進而促進C/EBPs的表達[11]；胰島素，通過IGF- 1激活有絲分裂原蛋白激酶途徑誘導前脂肪細胞的增殖分化[2]。

PPARγ為脂肪特異性核受體，調(diào)控脂肪細胞相關(guān)功能蛋白的表達。是體外脂肪細胞誘導過程的關(guān)鍵因素[12]。C/EBPs則為脂肪細胞誘導分化過程中的另一關(guān)鍵因素，能夠加速終末期脂肪細胞的分化，并通過與PPARγ的共同作用進一步促進脂肪細胞的生成。此外，C/EBPα為C/EBPs成員之一，其含有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，能夠與多個脂肪細胞基因的啟動子結(jié)合，加速成纖維細胞向脂肪細胞的轉(zhuǎn)化[13- 14]。加入誘導劑的目的是為了增加上述調(diào)控因子的表達，進而縮短脂肪細胞的轉(zhuǎn)化過程。

不同的研究所使用的誘導劑濃度不盡相同，Scott等[2]對PubMed數(shù)據(jù)庫45篇文獻中的3種誘導劑濃度進行了統(tǒng)計匯總，其中，IBMX作用濃度相對固定，為500 μmol/L；但亦有個別報道用低濃度，如0、100、250 μmol/L[15- 17]。對于地塞米松而言，不同研究中濃度不同，大多使用1000 nmol/L。胰島素濃度波動則較大，介于0.01～5 μg/ml間。通過觀察不同濃度的胰島素對脂肪細胞轉(zhuǎn)化和脂滴融合的影響，發(fā)現(xiàn)1 μg/ml濃度時脂滴形態(tài)最好[4]。因此，在經(jīng)典誘導方法中多采用以下濃方案：IBMX(0.5 mmol/L)、地塞米松(0.25 μmol/L)、胰島素(1 μg/ml)。

血清的選擇FBS是3T3-L1細胞誘導轉(zhuǎn)化過程中不可或缺的[18]，其包含的生長激素(growth hormone，GH)(10% FBS含有 4～10 ng/ml GH)能夠激活PARPγ的表達，進而加速脂肪形成，促進脂滴融合，且只有細胞進入轉(zhuǎn)化狀態(tài)后FBS才能發(fā)揮其促轉(zhuǎn)化作用[19]。有研究在誘導過程中將其替換為小牛血清或成年牛血清，脂肪細胞的轉(zhuǎn)化率明顯降低[20]。所以，在細胞培養(yǎng)時選擇小牛血清后換為FBS進行誘導，可在發(fā)揮FBS的作用同時節(jié)省成本。

2004年，有研究提出了信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)理論，即FBS中所含有的GH為STATs的激活劑，通過激活STATs的表達，進而促進3T3-L1的轉(zhuǎn)化，并提出STATs的激活劑GH或泌乳素來替代FBS的理論。以降低脂肪模型建立的成本，但目前缺乏大量的試驗對此方法進行肯定[21]。

改良誘導方法

隨著體外脂肪細胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)誘導方法存在轉(zhuǎn)化率低且不均勻的問題[1]。Mehra等[22]研究認為，細胞培養(yǎng)板廠商型號對細胞的轉(zhuǎn)化率有明顯影響，通過選擇合適的培養(yǎng)板后轉(zhuǎn)化率基本可達到80%。Lee等[23]發(fā)現(xiàn)3T3-L1脂肪細胞轉(zhuǎn)化不一致，為避免轉(zhuǎn)化細胞數(shù)不均勻?qū)嶒灥挠绊懀麄儗D(zhuǎn)化得到的脂肪細胞進行分離，之后再進行相關(guān)實驗研究。培養(yǎng)板的影響機制并未闡述且不能排除偶然性的存在，而分離轉(zhuǎn)化的脂肪細胞則進一步加重了實驗的工作量，且兩者均未在誘導方法上做任何改良。

改良雞尾酒誘導法是在經(jīng)典雞尾酒誘導法的基礎上，針對其轉(zhuǎn)化率低和不均勻等問題，從增加誘導劑Ⅰ和/或Ⅱ的作用時間以及新的誘導藥物等方面進行改良，從而提高脂肪細胞的轉(zhuǎn)化率，為體外脂肪細胞模型建立提供更為穩(wěn)定的培養(yǎng)方法，進一步輔助完成脂肪細胞代謝及功能相關(guān)疾病的研究。

增加誘導劑作用時間

誘導劑Ⅰ：Zhu等[24]在研究鋅-a2-糖蛋白抑制3T3-L1誘導轉(zhuǎn)化的脂肪細胞的分化和增殖時，誘導劑Ⅰ的作用時間為72 h，相比傳統(tǒng)雞尾酒法增加24 h，其轉(zhuǎn)化率達到90%以上。

誘導劑Ⅱ：Lee等[25]則保持誘導劑Ⅰ作用時間不變，而將誘導劑Ⅱ的作用時間增加至72 h；還有一些研究者將誘導劑Ⅱ的作用時間延長至120 h[26]，據(jù)報道其轉(zhuǎn)化率為80%以上。

誘導劑Ⅰ和Ⅱ：Lu等[27]在研究短暫性低氧對脂肪細胞分化過程中胰島素敏感性和三酰甘油融合情況的影響時，同時將誘導劑Ⅰ和Ⅱ的作用時間均延長至96 h，其轉(zhuǎn)化率同樣在80%以上。

還有許多研究根據(jù)傳統(tǒng)誘導藥物作用機制，針對脂肪誘導的方法進行了改良，以解決體外脂肪細胞模型建立時轉(zhuǎn)化率低的問題。Hua等[28]將誘導劑Ⅰ中的一種試劑IBMX的作用時間增加至96 h，即在誘導劑Ⅱ中加入IBMX，其轉(zhuǎn)化率為90%。

我們前期研究對傳統(tǒng)誘導方法中誘導劑Ⅰ的作用時間進行了對比，比較了誘導時間分別為48、72、96 h時研究所得到的脂肪細胞在轉(zhuǎn)化率和生物活性上的差異，結(jié)果顯示，72 h時細胞的轉(zhuǎn)化率和脂肪成熟情況均較好。因此，我們建議在體外脂肪細胞的誘導中將誘導劑Ⅰ的作用時間調(diào)整為72 h[29]。但在延長誘導劑作用時間的基礎上能否縮短后期脂滴融合時間，進而實現(xiàn)既提高轉(zhuǎn)化率又節(jié)省誘導總時間，仍待進一步研究。

新增藥物曲格列酮為PPARγ激動劑之一。Vishwanath等[30]在傳統(tǒng)誘導劑Ⅰ中加入40 μmol/L曲格列酮，其他細胞培養(yǎng)和誘導方法與傳統(tǒng)誘導法相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入曲格列酮后3T3-L1細胞在第10～12天時基本上全部轉(zhuǎn)化為脂肪細胞，轉(zhuǎn)化率明顯高于對照組，且脂滴融合持續(xù)時間至少為10 d。

甲狀腺素在脂肪細胞誘導過程中同樣能夠增加PPARγ1、2的表達。Mishra等[31]在對3T3-L1脂肪細胞進行培養(yǎng)誘導時，誘導劑為1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、2 nmol/L甲狀腺素T3(對照組不加)，誘導時間延長至60 h，所用細胞培養(yǎng)基同傳統(tǒng)誘導方法。在誘導后第7天通過油紅O染色觀察，結(jié)果顯示甲狀腺素組轉(zhuǎn)化率高出對照組2～5倍。同時，該研究也增加了誘導劑IBMX和地塞米松的作用時間，再一次證實了作用時間對脂肪細胞轉(zhuǎn)化率的影響。

上述兩種新的誘導藥物均通過激活PARPγ表達來提高脂肪細胞的轉(zhuǎn)化率。還有一些研究在3T3-L1脂肪細胞誘導時加入某種藥物，如苯基乳酸(一種從植物乳酸桿菌中提取的物質(zhì))、非諾貝特(過氧化物酶增殖體受體激活物受體a)、西地那非(5型磷酸二酯酶抑制劑)、雷洛昔芬(選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)，上述藥物均能夠提高脂肪細胞轉(zhuǎn)化率[32- 35]。但其研究目的是為了證明藥物對脂肪代謝的影響，并非輔助脂肪細胞模型的建立，此類藥物能否用于3T3-L1脂肪細胞的誘導尚需研究證明。目前尚無公認的新藥物。

此外有學者研究發(fā)現(xiàn)，3T3-L1細胞的克隆代數(shù)對細胞轉(zhuǎn)化率也有影響，1～20代的細胞隨機種板，分別進行3T3-L1細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化的誘導培養(yǎng)，結(jié)果除了第2代細胞沒有轉(zhuǎn)化外，其他代數(shù)細胞均可以轉(zhuǎn)化，其中第5代3T3-L1細胞的轉(zhuǎn)化率最高[2]。因此，在進行脂肪細胞誘導時最好將細胞代數(shù)控制在7代以內(nèi)，同時細胞傳代時應控制其細胞數(shù)目為70%～80%時進行，一旦細胞進入接觸抑制期后其分化潛能將明顯下降。

展 望

面對人類脂肪代謝性疾病發(fā)病率高的這一現(xiàn)實問題，成熟脂肪細胞體外模型的建立就越發(fā)重要。針對傳統(tǒng)誘導方法所遇到的問題進行方法的改良，將會為之后的相關(guān)脂肪代謝問題研究提供更好的體外模型。目前，如何選擇一個比較一致的誘導方案，以便為不同的研究提供標準化的操作步驟，進而增加不同研究結(jié)果間的可比性，將是未來研究的重點。具體地，在誘導劑濃度、誘導時間、新增誘導藥物等方面均需進一步研究驗證。

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ResearchProgressoftheDifferentiationof3T3-L1PreadipocytesintoMatureAdipocytes

LIU Xiu，LIU Xinong，LI Tianjia，LIU Bao

Department of Vascular Surgery，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

LIU Bao Tel：010- 69152502，E-mail：liubao72@aliyun.com

Along with the increase in the prevalence of lipid metabolism disorders，invitroresearch on the adipocytes has been a hot topic in recent years. 3T3-L1 preadipocyte line is one of the most commonly used cell line for establishing adipocytes models. However，for 3T3-L1 cell lines，the traditional method，known also as the “Cocktail” method，have disadvantages including low transformation rate and heterogeneous conversion. Therefore，many studies aimed to improving the induction method by changing the time of inducers or adding other new drugs have been performed(known as the improved method). The present study was to summarize the progress of the traditional methods and the improved methods for inducing 3T3-L1 cell lines to mature adipocytes.

3T3-L1 cell lines；adipocyte models；differentiation rate；traditional method；improved method

劉 暴 電話：010- 69152502，電子郵件：liubao72@aliyun.com

R34

A

1000- 503X(2017)05- 0727- 05

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.05.021

ActaAcadMedSin，2017,39(5)：727-731

2016- 08- 12)