肺炎支原體的實驗室檢測技術(shù)研究進展

李青曌，史文元，陳虹亮,2

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.016

肺炎支原體的實驗室檢測技術(shù)研究進展

李青曌1，史文元1，陳虹亮1,2

肺炎支原體是引起呼吸道感染的重要病原體之一。近年來，我國肺炎支原體發(fā)病率呈不斷上升趨勢，占小兒肺部疾病發(fā)病率的30%。肺炎支原體感染后早期臨床癥狀不典型，并且對作用于細胞壁的抗生素不敏感，所以早期實驗室檢測對肺炎支原體的治療具有重要意義。因此，本文就關于肺炎支原體檢測的實驗研究進展及展望進行簡要綜述。

肺炎支原體；檢測技術(shù)；進展

肺炎支原體(Mycoplasmapneumonia,Mp)是一種介于細菌與病毒之間、在有氧或無氧環(huán)境中均能獨立存活的最小病原微生物，主要通過呼吸道飛沫或氣溶膠傳播，是引起社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體之一[1-2]。Mp感染早期臨床癥狀與其他細菌和病毒感染肺炎無明顯區(qū)別，多見劇烈咳嗽、發(fā)熱(常為稽留熱)、畏寒、頭痛和咽痛[3-5]，且對作用一般細菌細胞壁的抗生素，如青霉素、頭孢菌素等不敏感，必須需選用抑制蛋白質(zhì)合成的大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類抗生素進行治療[6-8]。因此，Mp的早期實驗室檢測對合理選用抗生素治療具有重要意義。目前Mp實驗室檢測方法主要有分離培養(yǎng)、抗原檢測、抗體檢測和基因診斷技術(shù)檢測等。

1 分離培養(yǎng)

Mp分離培養(yǎng)作為傳統(tǒng)的檢測手段，是判斷Mp感染的“金標準”。Mp分離培養(yǎng)常以牛心消化液為基礎另加20%小牛血清及新鮮酵母浸液制成液體或固體培養(yǎng)基，初次分離需要孵育7～15 d，待培養(yǎng)基指示劑由粉紅色變黃色后，及時轉(zhuǎn)種于固體平板培養(yǎng)基，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)1～2周可長出菌落直徑小于0.5 mm 的荷包蛋樣菌落，以此可初步診斷，再進一步進行生化反應和血清學鑒定[9]。Kashyap等[10]認為采用咽拭子或痰液標本進行Mp分離培養(yǎng)是目前檢測Mp感染的可靠方法之一，但是Mp分離培養(yǎng)對培養(yǎng)環(huán)境要求較苛刻，耗時長，一般培養(yǎng)分離陽性率不高，難以作為臨床常規(guī)項目開展。近年來，Puppe等研發(fā)出快速檢測Mp的培養(yǎng)基，它是利用Mp生長代謝產(chǎn)物讓培養(yǎng)基液體中指示劑從紅色變成澄黃色來判斷Mp生長，快速培養(yǎng)法直接檢測Mp病原體，且培養(yǎng)基中富含高營養(yǎng)和快速生長因子，標本中含有微量的病原體就可迅速增殖，大大縮短了培養(yǎng)時間。還有研究報道，該方法檢測Mp的假陽性率較高，但容易被細菌和真菌污染而造成假陽性，故該方法特異性還有待進一步提高，因此有必要在培養(yǎng)48 h作第一次判定結(jié)果后轉(zhuǎn)種進一步做一般細菌培養(yǎng)。

2 抗原檢測

Mp抗原檢測方法包括對流免疫電泳(counter immunoelectro - phoresis)、免疫印跡(immunoblot-ting)和抗原捕獲EIA(antigen capture enzym eimmunoas-say) ，這些方法操作耗時費力，敏感性較低，并且檢測過程中需Mp特異性抗體，不適于臨床檢測。Miyashita N等[11]以不同菌株Mp單克隆抗體作為包被物，采用雙抗體夾心ELISA檢測Mp抗原，同時以PCR法作平行測定，結(jié)果顯示兩種方法無顯著性差異。該方法具有快速、簡便、靈敏度高、特異性強等諸多優(yōu)點，并且和其它支原體沒有交叉反應，但同時亦需要特異性好、效價高的Mp單克隆抗體，所以未能廣泛普及，目前市場還尚無商品化的Mp抗原檢測試劑盒。

3 血清學檢測

Mp感染機體后，經(jīng)過免疫反應體內(nèi)可產(chǎn)生特異性的IgM、IgG類抗體，其中IgM抗體在感染1周后可檢測出陽性，3～4周后達高峰，能作為早期感染的診斷指標。IgG抗體出現(xiàn)較遲，其濃度峰在Mp感染后的第5周，一般提示有既往感染，單獨檢測意義不大[4,12]。Mp血清學檢測主要包括非特異性抗體試驗和特異性抗體試驗。

3.1 非特異性抗體試驗Mp感染機體后，血清中除出現(xiàn)特異性抗體外，還存在刺激機體產(chǎn)生的非特異性冷凝集素。該凝集素能與O型Rh陰性紅細胞在4 ℃條件發(fā)生凝集反應，血清滴度≥1∶64，判為陽性，效價越高或者雙份血清效價呈4倍以上，提示近期Mp感染的可能性較大。非特異凝集試驗操作簡單，但其特異性相對較低，除Mp感染患者外，如流感病毒、立克次體和腺病毒等感染也會產(chǎn)生冷凝集素，造成假陽性，因此該方法只可作為輔助診斷Mp感染的方法。

3.2 特異性抗體試驗Mp特異性抗體試驗包括補體結(jié)合試驗(Complement fixation test，CFT)、顆粒凝集試驗(particle agglutination test, PAT/PA)、間接血凝試驗(indirect hemagglutination test, IHT)、間接免疫熒光試驗(Immuno-fluorescence test, IFT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assays, ELISA)。

3.2.1 CFT試驗 CFT試驗是最早應用于Mp實驗室常規(guī)診斷的試驗方法。Mp的抗原糖脂成分可刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，與Mp抗體結(jié)合后形成固有補體使之不發(fā)生溶血反應[13]。該方法以Mp糖脂類抗原為標記物，檢測血清中是否存在Mp抗體，其中抗體效價呈倍增長，或單份血清效價≥1∶64～1∶128 者有診斷價值，通常用雙份血清試驗可判定Mp感染是否處于急性期或恢復期。劉方鶴等報道CFT試驗反應穩(wěn)定，敏感性和特異性均好，但較為煩瑣，且以檢測IgM抗體為主，不能檢測IgG等抗體，初次感染時出現(xiàn)陽性率高，再感染者容易出現(xiàn)假陰性，并且在老年體弱患者中，因此，即使CFT試驗呈陰性也不可以排除Mp感染，故臨床應用較少。

3.2.2 PA試驗 PA試驗是采用致敏粒子與試驗血清進行孵育發(fā)生凝集的血清學試驗。雙份血清(間隔2周)抗體滴度呈4倍或4倍以上上升或降低或抗體滴度持續(xù)>1∶160時，均可確診為Mp感染，這是目前國際公認的標準。我國學者靳冰等研究結(jié)果顯示PA試驗靈敏度為96.4%，特異性為100%，以及準確度為97.9%，說明PA試驗特異性強，操作簡便，適用于臨床快速診斷，但該方法采用的Mp進口試劑價格昂貴，窗口期不能被檢測，易造成漏檢。

3.2.3 IHT試驗 IHT試驗主要用于檢測IgM抗體，在微量凝血板上被檢血清與血清對照，其余各孔加致敏紅細胞后震蕩混勻，紅細胞凝集程度在“”、血凝抗體滴度≥1∶32以上即有診斷意義[14]。李正秋等報道，IHT實驗的靈敏度為97.5%，顯著高于ELISA檢測法86.5%，其特異性70.9%不及ELISA檢測法91.5%，二者聯(lián)合檢測可提高檢測陽性率。該試驗操作方法相對簡單、快捷，但因其特異性不高，且與生殖道支原體存在交叉反應而未推廣。

3.2.4 IFT試驗 IFT試驗是標記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。該法以培養(yǎng)基中生長的Mp菌落制作抗原印片，與被檢血清(Mp-IgM、IgG抗體)孵育形成抗原抗體復合物，再用抗抗體的熒光標記抗體著色，熒光顯微鏡下觀察，效價>1∶16為陽性[11, 15]。有學者報道IFT試驗檢測Mp感染陽性率為64%，靈敏度為98.3%，特異性為87.5%，明顯優(yōu)于快速培養(yǎng)基法(陽性率26%，靈敏度為33.3%，特異性為85%)，兩方法比較而言，該方法特異性較高，但需購置熒光顯微鏡才能觀察，只適用于一般實驗室。

3.2.5 ELISA試驗 ELISA試驗利用酶標記抗體作為標志物，并將提純的Mp膜蛋白P1、P116或P30抗原[16-17]吸附在固相載體表面，再用洗滌液將游離成分洗除，最后加入TMB底物后顯色來判斷結(jié)果。ELISA法是國內(nèi)應用較為成熟的實驗方法，目前臨床上多應用商品化試劑盒來進行快速簡便檢測，Narita Mitsu等研究認為ELISA法具有較好的準確度和特異性，可分別高達96%、98%，優(yōu)于CFT法，是診斷Mp感染實用可靠的手段，并且敏感、快速，適合于各級臨床實驗室，可作為Mp感染的常規(guī)檢測方法。

4 分子生物學檢測

自1980年以來，通過實驗室和臨床研究，證實了聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)檢測Mp感染的可靠性，目前PCR技術(shù)也是國內(nèi)外發(fā)展較快的檢測支原體的方法之一。PCR可分為普通PCR、實時熒光定量PCR， 而普通PCR容易被污染而出現(xiàn)假陽性；實時熒光定量PCR具有快速，特異性強，靈敏度高等特點且無交叉反應現(xiàn)象，對Mp感染的診斷價值優(yōu)于普通PCR法。運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測患者痰液、咽拭子、支氣管灌洗液中的Mp-DNA，通過高溫加熱使模板的兩條DNA鏈解鏈后，引物分別與模板DNA和熒光探針一起退火，通過基因擴增技術(shù)，可以在短時間內(nèi)使含量極低的核酸片段擴展至數(shù)百萬個拷貝，可檢出≥10 cfu/mL的Mp[18]。佟青研究發(fā)現(xiàn)，PCR診斷Mp感染的陽性率為73%，明顯高于培養(yǎng)法25%，但血清學陽性率為98.5%，PCR靈敏度不及血清學，但特異性能達到97%，在Mp感染早期診斷優(yōu)于培養(yǎng)法和血清學試驗。PCR技術(shù)大大提高了檢測特異性，并且可了解Mp在患者體內(nèi)感染及自我復制的情況，對早期檢測Mp感染具有重要意義[19]。但其過于敏感，操作不當或環(huán)境因素容易受到污染會導致結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性，另外該技術(shù)要求特殊儀器設備，較高的人員素質(zhì)，所以在縣級醫(yī)院中難以普及。

5 展 望

綜上所述，基于分離培養(yǎng)、抗原檢測、抗體檢測和基因診斷技術(shù)為Mp感染的診斷提供了非常有效的檢測手段，但迄今為止還尚無統(tǒng)一的Mp實驗室檢測方法。由于各種檢測技術(shù)參差不齊，各種檢測手段都有優(yōu)缺點，建議根據(jù)臨床要求，選擇合適的檢測方法，如Mp初篩可選用靈敏度較高的ELISA法、確診可采用特異性較好的分子生物學診斷方法，同時還可采用多種檢測手段結(jié)合可提高Mp感染陽性檢出率。相信隨著Mp基礎研究的深入以及檢測技術(shù)的進一步發(fā)展，必將發(fā)現(xiàn)新的Mp檢測靶點，并開發(fā)出更加特異、敏感的檢測方法，從而能夠準確、快速地診斷Mp感染。

[1] Waites KB, Balish MF, Atkinson TP. New insights into the pathogenesis and detection ofMycoplasmapneumoniae infections[J]. Future Microbiol, 2017, 3(6): 635-648. DOI: 10.2217/17460913.3.6.635

[2] Ravelomanana L, Bouazza N, Rakotomahefa M, et al. Prevalence ofMycoplasmapneumoniae infection in Malagasy children[J]. Pediatr Infect Dis J, 2017, 36(5): 467-471. DOI: 10.1097/INF.0000000000001471

[3] Wang HR, Xiao JX, Yan YS. Epidemiology ofMycoplasmapneumoniae infection[J]. Chin J Zoonoses, 2010, 26(11): 1062-1066. (in Chinese)

王惠榕，蕭劍雄，嚴延生. 肺炎支原體感染的流行病學研究進展[J]. 中國人獸共患病學報，2010，26(11)：1062-1066.

[4] Rogozinski LE, Alverson BK, Biondi EA. Diagnosis and treatment ofMycoplasmapneumoniae in children[J]. Minerva Pediatr, 2017, 69(2): 156-160. DOI: 10.23736/S0026-4946.16.04866-0

[5] Chang Q, Yan C, Yu R, et al. Distribution ofMycoplasmapneumonia and respiratory pathogens in the specimen collected from Wuxi in the spring of 2015[J]. Chin J Zoonoses, 2016, 32(7): 636-640. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.009 (in Chinese)

常青, 閆超, 俞蓉, 等. 2015年春季無錫地區(qū)兒童肺炎支原體及呼吸道常見致病菌的分析[J]. 中國人獸共患病學報，2016，32(7)：636-640.

[6] Lu A, Wang L, Zhang X, et al. Combined treatment for child refractoryMycoplasmapneumoniaepneumonia with ciprofloxacin and glucocorticoid[J]. Pediatric Pulmonol, 2011, 46(11): 1093-1097. DOI: 10.1002/ppul.21481

[7] Li ZW, Xiao GW, Zhang GX, et al.Mycoplasmapneumoniae infection and drug resistance in children in Meizhou area from 2010 to 2014[J]. Chin J Zoonoses, 2016, 32(3): 306-311. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.019 (in Chinese)

李舟文， 肖光文，張國雄，等. 梅州地區(qū)2010-2014年兒童肺炎支原體感染及耐藥情況分析[J]. 中國人獸共患病學報，2016，32(3)：306-311.

[8] Ishiguro N, Koseki N, Kaiho M, et al. Therapeutic efficacy of azithromycin, clarithromycin, minocycline and tosufloxacin against macrolide-resistant and macrolide-sensitive Mycoplasma pneumoniae pneumonia in pediatric patients[J]. PLoS One, 2017, 12(3): e0173635. DOI: 10.1371/journal.pone.0173635

[9] Miyashita N, Kawai Y, Kato T, et al. Rapid diagnostic method for the identification ofMycoplasmapneumoniae respiratory tract infection[J]. J Infect Chemother, 2016, 22(5): 327-330. DOI: 10.1016/j.jiac.2016.02.005

[10] Kashyap S, Sarkar M.Mycoplasmapneumonia: Clinical features and management[J]. Lung India, 2010, 27(2): 75-85. DOI: 10.4103/0970-2113.63611

[11] Miyashita N, Kawai Y, Tanaka T, et al. Diagnostic sensitivity of a rapid antigen test for the detection ofMycoplasmapneumoniae: Comparison with real-time PCR[J]. J Infect Chemother, 2015, 21(6): 473-475. DOI: 10.1016/j.jiac.2015.02.007

[12] Messous S, Trabelsi I, Grissa MH, et al. Prevalence ofChlamydophilapneumoniae andMycoplasmapneumoniae IgM and IgG antibodies in Tunisian patients presenting with exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease[J]. Med Mal Infect, 2017, 47(2): 158-163. DOI: 10.1016/j.medmal.2016.12.002

[13] Bébéar CM. Pathogenesis and laboratory diagnosis ofMycoplasmapneumoniae infections[J]. Arch Pediatr, 2008, 15(7): 1253-1256. DOI: 10.1016/j.arcped.2008.02.010

[14] Jha AK, Das A, Chowdhury F, et al. Clinicopathological study and management of liver abscess in a tertiary care center[J]. J Nat Sci Biol Med, 2015, 6(1): 71-75. DOI: 10.4103/0976-9668.149091

[15] Wang XM, Zheng DX, Liang SY, et al. Analysis of assays to community-acquiredMycoplasmapneumoniae infection in the elderly patients[J]. Chin J Zoonoses, 2015, 31(2): 189-190. DOI: 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.021 (in Chinese)

王希敏，鄭東旭，梁雙吟，等. 老年獲得性肺炎支原體感染的檢測與分析[J]. 中國人獸共患病學報，2015，31(2)：189-190.

[16] Tabassum I, Chaudhry R, Chourasia BK, et al. Identification of an N-terminal 27 kDa fragment ofMycoplasmapneumoniae P116 protein as specific immunogen in M. pneumoniae infections[J]. BMC Infect Dis, 2010, 10: 350. DOI: 10.1186/1471-2334-10-350

[17] Drasbek M, Nielsen PK, Persson K, et al. Immune response toMycoplasmapneumoniaeP1 and P116 in patients with atypical pneumonia analyzed by ELISA[J]. BMC Microbiol, 2004, 4(1): 7. DOI: 10.1186/1471-2180-4-7

[18] Li C, Wu YM. Comparision of clinical diagnostic value between PCR and TaqMan real-time PCR for M. pneumoniae in throat swabs[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28(2): 127-130. (in Chinese)

李淳，吳移謀. 兩種不同方法檢測咽拭子標本中肺炎支原體臨床診斷價值的比較[J]. 中國人獸共患病學報, 2012, 28(2): 127-130.

[19] Loens K, Ieven M.Mycoplasmapneumoniae: current knowledge on nucleic acid amplification techniques and serological diagnostics[J]. Front Microbiol, 2016, 7: 448. DOI: 10.3389/fmicb.2016.00448

ProgressinclinicaldetectionofMycoplasmapneumonia

LI Qing-zhao, SHI Wen-yuan, CHEN Hong-liang

(1.FirstPeople’sHospitalofChenzhou,Chenzhou423000,China; 2.InstituteofTranslationalMedicine,UniversityofSouthChina,Chenzhou423000,China)

Mycoplasmapneumoniais one of the important pathogens leading to respiratory tract infection. Recently, the incidence ofM.pneumoniaeinfection increased rapidly, which contributes about 30% of lung disease in children. The early clinical symptoms forM.pneumoniaeinfection is not typical, which is not sensitive to antibiotics acting on cell walls. Therefore, early laboratory detection ofM.pneumoniaeis very important for later treatment. Herein, this paper aims to sum up the recent development progress ofM.pneumoniaedetection.

Mycoplasmapneumonia; detection technology; progress

Chen Hong-liang, Email: chenhongliang2007@126.com

陳虹亮，Email: chenhongliang2007@126.com

1.郴州市第一人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，郴州 423000； 2.南華大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究所，郴州 423000

R375

：A

：1002-2694(2017)09-0841-04

2017-03-29編輯：劉岱偉

郴州市科技局科技計劃項目(czkj2016052, czkj2016045)資助

Supported by the Foundation of Chenzhou Municipal Science and Technology Bureau (Nos. czkj2016052 and czkj2016045)