豬病毒病病毒樣顆粒疫苗研究進(jìn)展

于新友 ，李天芝 ，李 峰

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

病毒樣顆粒(Virus like particles，VLPs)是由病毒的一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白在異源系統(tǒng)內(nèi)重組表達(dá)，并在該系統(tǒng)內(nèi)或系統(tǒng)外自動(dòng)裝配成的一種不含病毒核酸的高度結(jié)構(gòu)化空心顆粒[1]。VLPs大小介于15～400 nm之間[2]，形態(tài)上類似于真正的病毒粒子，不含病毒核酸，無(wú)法復(fù)制和擴(kuò)增，因此，不具有感染性，安全性好[3]。VLPs保留了天然病毒粒子的空間構(gòu)象和誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位，免疫原性強(qiáng)，可模擬病毒感染途徑，被呈遞給免疫細(xì)胞，激發(fā)機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫及黏膜免疫等免疫應(yīng)答。VLPs具有病原體相關(guān)模式分子的活性，也可激活固有免疫應(yīng)答。VLPs疫苗作為一種新型的亞單位疫苗，具有穩(wěn)定性高、免疫原性好、安全性高[4]、適宜大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)疫苗相比，VLPs具有相當(dāng)?shù)拿庖咴院透玫陌踩远蔀橐环N理想的疫苗形式，自從出現(xiàn)后就受到了人們的普遍重視，VLPs在結(jié)構(gòu)上允許外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并將外源性抗原展示在其表面。此外，多數(shù)病毒VLPs還具有包裹核酸或其他小分子的能力，可作為基因或藥物的運(yùn)載工具[5、6]，是研制安全高效的預(yù)防病毒性疾病的潛在候選疫苗。迄今為止，國(guó)內(nèi)外針對(duì)VLPs進(jìn)行了大量的研究，本文就VLPs在豬病毒病防治應(yīng)用方面的研究進(jìn)行綜述，以期為豬病毒病的防控工作提供新的思路。

1 VLPs的免疫機(jī)制

與其他亞單位疫苗和重組蛋白疫苗相比，VLPs的免疫原性更強(qiáng)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，主要是VLPs的抗原表位與天然病毒類似，并高度模仿了天然病毒的空間構(gòu)象，表面有可被B淋巴細(xì)胞表面受體識(shí)別的成分，活化B淋巴細(xì)胞，上調(diào)組織相容性復(fù)合體MHCⅡ類分子水平，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，從而誘發(fā)免疫反應(yīng)。外源的VLPs也能通過(guò)交叉提呈的方式，通過(guò)MHC-Ⅰ類途徑進(jìn)行提呈，從而活化CD8 T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)CD8細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)，這對(duì)于清除細(xì)胞內(nèi)的病原體如病毒等至關(guān)重要。因在遞呈給樹突狀細(xì)胞加工、被MHCⅡ類分子展示以及直接引起樹突狀細(xì)胞成熟和遷移的過(guò)程中，VLPs的大小適合被樹突狀細(xì)胞(DCs)通過(guò)吞噬、滲透及Toll樣受體（TLR受體）介導(dǎo)等方式高效攝取，所以具有一定的免疫佐劑分子效應(yīng)，單獨(dú)免疫動(dòng)物就能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。VLPs能模擬天然病毒的體內(nèi)感染過(guò)程，從而激活抗原遞呈細(xì)胞，尤其是進(jìn)入樹突狀細(xì)胞（DCs）后，能上調(diào)DCs的數(shù)量并促進(jìn)其成熟，使其細(xì)胞表面分子如CD40、CD80、CD86及 MHC- Ⅰ 和Ⅱ類分子表達(dá)水平明顯上調(diào)，同時(shí)促進(jìn)DCs分 泌 IL-6、IL-10、MIP-1α 及TNF-α等細(xì)胞因子，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。

2 豬病毒病病毒樣顆粒疫苗研究進(jìn)展

2.1 豬圓環(huán)病毒病

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，此外，PCV2還與豬呼吸道綜合征、豬皮炎與腎炎綜合征和繁殖障礙以及腸炎等疾病有關(guān)，是一種免疫抑制性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。趙曉云等[8]根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率表優(yōu)化合成PCV2 NJ株ORF2基因，將其插入原核表達(dá)載體pQZ1，鑒定陽(yáng)性后轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21，對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明PCV2 NJ株優(yōu)化的ORF2基因在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以完全可溶性形式存在于菌體超聲波破碎后的上清液中，Western-blotting分析結(jié)果顯示，表達(dá)的重組Cap蛋白能夠與PCV2陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，電鏡觀察，可見大量直徑在17 nm左右的PCV2 VLPs存在于超聲破碎后的上清液中，500μg/頭重組VLPs疫苗免疫豬產(chǎn)生較高的抗體水平，單次免疫后21 d抗體100%達(dá)到合格，對(duì)PCV2強(qiáng)毒的攻擊提供完全保護(hù)。Chi等[9]采用同源重組技術(shù)構(gòu)建了含PCV2的Cap基因的重組PRV病毒株gE(-)/PCV2cap(+)PRV。通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和Westernblotting方法證實(shí)重組病毒復(fù)制過(guò)程中可表達(dá)Cap蛋白。電子顯微鏡結(jié)果顯示，所表達(dá)的Cap蛋白能組裝成VLPs。用純化的VLPs免疫小鼠和豚鼠可產(chǎn)生針對(duì)PCV2 Cap的特異性免疫應(yīng)答。

2.2 豬口蹄疫

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動(dòng)物常發(fā)的一種烈性傳染病，豬口蹄疫臨床表現(xiàn)主要為蹄冠、趾間、蹄踵皮膚發(fā)生水泡和爛斑，部分豬口腔黏膜和鼻盤也有同樣病變。潘群興等[10]將O型FMDV VP1中編碼T細(xì)胞表位肽(aa21-aa40)序列連接于PPV VP2的5’端，并插入到桿狀病毒供體質(zhì)粒pFastBacHTA中，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac-FMDVVP1-PPV-VP2，轉(zhuǎn)化含有穿梭載體Bacmid的大腸桿菌感受態(tài)DH10Bac中，經(jīng)藍(lán)白菌落篩選獲得重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒rBac-FMDV-VP1-PPVVP2，轉(zhuǎn)染昆蟲草地夜蛾細(xì)胞(Sf9)，并在Sf9中進(jìn)行了表達(dá)。電鏡觀察顯示，表達(dá)的重組蛋白能自我組裝成病毒樣顆粒，用IFA、Western-blotting分析表明，表達(dá)產(chǎn)物具有與PPV VP2天然蛋白相似的免疫原性。小鼠免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在低濃度FMDV抗原下能夠產(chǎn)生特異性T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，而且該病毒樣顆粒能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗FMDV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。董艷美等[11]根據(jù)豬源FMDV VP1上第141-160位氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，利用重疊延伸PCR技術(shù)將該序列插入在大腸桿菌噬菌體MS2外殼蛋白基因的特定位點(diǎn)。然后連接到原核表達(dá)載體pET28a上，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒28a-CPVP1，轉(zhuǎn)化BL21，ITPG誘導(dǎo)表達(dá)得到融合表達(dá)的CP-VP1蛋白，透射電子顯微鏡下觀察融合蛋白CP-VP1成類VLPs狀。間接ELISA試驗(yàn)證實(shí)該蛋白能夠特異地結(jié)合豚鼠抗O型FMDV的陽(yáng)性血清，30 μg的 CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生高效價(jià)的特異抗體。竇小龍等[12]為制備Asia 1型FMDV雙層結(jié)構(gòu)病毒樣顆粒，選擇牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)流行株核心蛋白p14的第169-270位氨基酸FMDVAsia1/JS/CHA/05結(jié)構(gòu)蛋白VP1的第1-211位氨基酸，兩者之間設(shè)計(jì)柔性肽連接，人工合成p14-柔性肽-VP1融合蛋白編碼序列，全基因長(zhǎng)990 bp。合成基因與枯草芽胞桿菌表達(dá)載體p7257-P43連接，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒p7257-P43-P14-VP1。轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌WB800，經(jīng)篩選、鑒定，獲得表達(dá)p14-VP1融合蛋白的枯草芽胞桿菌。該重組表達(dá)菌在含有40μg/mL氯霉素的LB中培養(yǎng)后，菌體超聲破碎可檢測(cè)到目的蛋白。Western-blotting結(jié)果顯示，該蛋白能特異性識(shí)別Asia 1型FMDV抗體，具有良好的反應(yīng)原性。電鏡觀察顯示，融合蛋白組裝為直徑約50 nm大小的VLPs。盛蓉等[13]以兔出血癥病毒(RHDV)衣殼蛋白VP60為載體，分別在RHDV衣殼蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之間插入FMDV B細(xì)胞表位(VP1 200-213aa)，得到嵌合VP60基因。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)嵌合蛋白，分別命名為VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。通過(guò)電鏡觀察嵌合蛋白自聚為病毒樣顆粒的能力，動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，將病毒樣顆粒免疫小鼠后均可產(chǎn)生針對(duì)VP60和B細(xì)胞表位特異的免疫應(yīng)答。

2.3 豬細(xì)小病毒病

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(PPV)引起的母豬繁殖障礙性疾病，主要臨床表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)畸形胎、胎兒木乃伊化和不孕等，初產(chǎn)母豬受到的危害最為嚴(yán)重[14]。VP2是PPV的主要衣殼蛋白，具有良好的免疫原性，當(dāng)用體外表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)時(shí)能自我裝配形成VLPs。另外，VP2蛋白可以作為一種抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，攜帶外源表位，組裝成嵌合表位VLPs，嵌合表位VLPs免疫動(dòng)物具有雙重的免疫效果。Antonis等[15]用桿狀病毒產(chǎn)生豬細(xì)小病毒樣粒子，用低于1μg的該VLPs以油包水的形式分別免疫豚鼠和豬，均產(chǎn)生了很高的血清抗體滴度，僅用0.7 fg豬細(xì)小病毒樣粒子免疫母豬，一次免疫就可以保護(hù)胎兒不受致死劑量的PPV的攻擊。陳楊[16]擴(kuò)增了PPV SC1株VP2基因，將其插入真核表達(dá)載體pPI-2.EG-FP中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pPI-2.EGFP.VP2。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將豬偽狂犬病病毒(PRV)SA215株DNA與pPI-2.EGFP.VP2DNA共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞獲得重組病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗體建立的免疫熒光技術(shù)可檢測(cè)到Vero細(xì)胞發(fā)出的特異性熒光，表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因組中，并獲得表達(dá)。進(jìn)一步電鏡觀察表明，感染PRV SA215/VP2的Vero細(xì)胞中可同時(shí)觀察到PRV與PPV兩種VLPs。徐志文等[17]構(gòu)建了含PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重組質(zhì)粒pEGFPVP2.ORF2，由脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行電鏡檢測(cè)，結(jié)果觀察到VLPs存在。將純化后的VLPs免疫仔豬，檢測(cè)其血中T淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化以及血清抗體水平。結(jié)果免疫仔豬的CD3、CD4 T淋巴細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞中的比率均有一定程度的升高，CD8 T淋巴細(xì)胞在免疫后7～14 d有所下降，之后再升高。抗體檢測(cè)結(jié)果表明，免疫動(dòng)物血清中有較高水平的PPV、PCV2特異性抗體。

2.4 豬乙型腦炎

日本腦炎(JE)是由乙型腦炎病毒(JEV)引起的感染性疾病，JEV可引起母豬繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大損失。JEV基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約11kb，含有三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，衣殼蛋白(C)，膜前體蛋白(prM)和包膜糖蛋白(E)。其中prM蛋白成熟后被剪切成M蛋白，與病毒感染能力相關(guān)，是病毒誘發(fā)保護(hù)性免疫的重要協(xié)同成分，可產(chǎn)生微弱的中和抗體。E蛋白為糖蛋白，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗體的主要抗原成份，可介導(dǎo)膜融合，引起血凝反應(yīng)。張艷芳等[18]將乙型腦炎病毒prME及其信號(hào)肽基因片段克隆到穿梭載體AcBacmid中，構(gòu)建重組穿梭載體AcBac-prME。其轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒Ac-prME。Western-blotting、間接免疫熒光試驗(yàn)及電鏡觀察，證實(shí)Ac-prME介導(dǎo)prME在Sf9細(xì)胞中高效表達(dá)，且形成了病毒樣顆粒。小鼠免疫和攻毒試驗(yàn)表明，該病毒樣顆粒免疫可以使小鼠獲得有效抵抗乙型腦炎病毒強(qiáng)毒株攻擊的能力，保護(hù)率高達(dá)100%。

2.5 豬繁殖與呼吸綜合征

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的母豬繁殖障礙性疾病，臨床表現(xiàn)主要為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎，妊娠母豬的后期流產(chǎn)，流產(chǎn)率可達(dá)30%以上，小豬的死亡率在35%～40%。PRRSV可經(jīng)口腔、鼻腔、肌肉及生殖道等多種途徑感染豬發(fā)病。王璐等[19]為構(gòu)建高致病性PRRSV(HP-PRRSV)VLPs疫 苗， 以HP-PRRSV CQ株的GP5和M蛋白的全部編碼基因?yàn)槟０?，利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠成功地共表達(dá)重組質(zhì)粒pFastBac1-GP5-M的GP5蛋白和M蛋白，并能自動(dòng)裝配成VLPs，電鏡觀察到VLPs的直徑約為50 nm，該VLPs與天然蛋白類似的免疫原性。呂鳳林等[20]公開了一種PRRSV VLPs的研究方法。該疫苗是由PRRSV GP5、M、N3種蛋白構(gòu)成的VLPs，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，形成的VLPs加入或不加入佐劑制備的注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型，免疫不同時(shí)期的豬群都能夠安全有效地預(yù)防PRRSV感染。Nam等[21]利用桿狀病毒表達(dá)載體，在Sf9昆蟲細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)GP5和M蛋白，成功制備出PRRSV VLPs，用蔗糖梯度離心方法對(duì)其進(jìn)行純化，并用不同量(0.5μg、1.0μ g、2.0μ g、4.0μ g)純化后的蛋白混合弗氏佐劑免疫小鼠，檢測(cè)血清抗體效價(jià)和細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ水平，結(jié)果顯示，該疫苗可以有效引起機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，其中GP5抗體效價(jià)顯著高于陰性對(duì)照，免疫4.0μ g劑量的IFN-γ水平顯著高于陽(yáng)性對(duì)照，但陽(yáng)性對(duì)照的IL-4、IL-10細(xì)胞因子水平高于試驗(yàn)組，同時(shí)僅在免疫2.0μ g和4.0μ g VLPs的小鼠體內(nèi)檢測(cè)到中和抗體水平。

2.6 豬瘟

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬急性、熱性、高度接觸性傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，其發(fā)病率和死亡率均高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害十分嚴(yán)重。范京惠等[22]構(gòu)建了含CSFV的優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位E290和PPV VP2基因的重組PM-VP2-E290，與Bac-N-BlueDNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9，獲得重組桿狀病毒將傳3代的重組桿狀病毒接種于形成50%單層的sf9細(xì)胞，應(yīng)用免疫電鏡對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行觀察，可見到許多VLPs，表明目的基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中得到了表達(dá)，且表達(dá)的蛋白能自我裝配成VLPs，大量表達(dá)VLPs后，在無(wú)佐劑參與的情況下，按確定的免疫程序免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，檢測(cè)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明，該VLPs不僅能誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗CSFV的特異性CTL反應(yīng)，還能刺激小鼠產(chǎn)生抗PPV的特異性中和抗體。

2.7 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎(TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水為主要特征高度傳染性疾病，各種不同品種和日齡的豬都能感染，2周齡受到的危害最為嚴(yán)重，死亡率可高達(dá)100%。冷勇等[23]構(gòu)建了含TGEV M和sM結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組桿狀病毒rBac-M和rBac-M-sM，將重組桿狀病毒rBac-M和rBac-M-sM分別感染sf9昆蟲細(xì)胞，進(jìn)行VLPs的體外組裝試驗(yàn)。結(jié)果表明，M蛋白在sf9細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)表達(dá)，M蛋白和sM在sf9細(xì)胞內(nèi)共同表達(dá)，都可形成TGEV VLPs，而且病毒粒子大小不等，直徑在61～101 nm。

2.8 豬流感

豬流感(SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。各種日齡和品種的豬均易感，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)病急、呼吸困難、咳嗽、流淚、鼻液增多、衰竭、低死亡率等[24]。在我國(guó)豬群中流行的血清型主要是H1N1、H1N2和H3N2。Quan等[25]用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了H1N1流感病毒血凝素和基質(zhì)蛋自，共同感染昆蟲細(xì)胞后形成VLPs。用該VLPs肌注免疫小鼠，僅免疫一次，即可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生以IgG2a為主的抗體反應(yīng)，并且產(chǎn)生很高的血凝抑制滴度和記憶性IgG和IgA反應(yīng)，更重要的是低劑量的VLPs就可產(chǎn)生抵抗致死劑量病毒感染的保護(hù)作用。

3 小結(jié)與展望

VLPs作為一種新型亞單位疫苗，具有多種優(yōu)點(diǎn)，不含有病毒核酸，不具有感染性，能模擬天然的病毒粒子，易被免疫系統(tǒng)識(shí)別，不需要佐劑，低劑量免疫后就能刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答發(fā)應(yīng)，因此，在某此程度上，有替代傳統(tǒng)的疫苗的潛力，在動(dòng)物疾病的防治方面有廣闊的應(yīng)用前景。但在VLPs的研制過(guò)程中也存在一些問(wèn)題，首先，VLPs疫苗的設(shè)計(jì)、表達(dá)、組裝及純化等對(duì)技術(shù)條件要求比較高，而且不是所有病毒都能組裝成VLPs。其次，當(dāng)組裝多種蛋白形成的病毒樣粒子時(shí)，各個(gè)基因表達(dá)量的比例難以控制，表達(dá)不同蛋白的載體進(jìn)入同一細(xì)胞的幾率小，產(chǎn)生VLPs的幾率相對(duì)降低，建立多基因共表達(dá)載體的難度大。另外，某些蛋白可能對(duì)細(xì)胞具有毒性，使其表達(dá)量較低，甚至引起其他蛋白的表達(dá)量降低，從而導(dǎo)致VLPs裝配效率的下降。再次，如何有效放大工藝水平，提高VLPs的組裝效率，降低成本等方面也存在著諸多挑戰(zhàn)。最后，VLPs采用不同的免疫途徑，其免疫效果不同，需要對(duì)不同的VLPs的免疫途徑進(jìn)行研究，找出最佳的免疫途徑。發(fā)展多樣的VLPs疫苗將是一個(gè)趨勢(shì)。VLPs作為一項(xiàng)新興的技術(shù)，在新型豬病疫苗的研制中代表了一種非常有前途的研究方向，相信通過(guò)各國(guó)專家學(xué)者的共同努力，不久的將來(lái)VLPs疫苗必將為豬病毒病的防控提供新的技術(shù)手段。

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