豬大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性試驗

（江蘇宿遷市宿豫區(qū)畜牧獸醫(yī)站，江蘇宿遷 223800）

1 實驗材料

1.1 病料

無菌采取天蓬養(yǎng)殖場患黃白痢仔豬肛試子4 份，分別編號為1～4 號；無菌采取農(nóng)家樂養(yǎng)殖場患黃白痢仔豬肛試子4 份，分別編號為 5～8 號，無菌采取圣天養(yǎng)殖場患黃白痢仔豬肛試子4 份，分別編號為 9～12號。

1.2 培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂，伊紅美蘭培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯，麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基均購自浙江微生物試劑有限公司。

1.3 試劑和材料

定型血清12種大腸桿菌O抗原單因子血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)督所。試驗所用的各種糖均購自上?；瘜W試劑二廠，生化試管、藥敏紙片購自廣東省某軍區(qū)后勤部，蛋白胨水溶液，甲基紅試劑，V-P試劑均按獸醫(yī)微生物學及免疫學指導的方法配置。

1.4 儀器

電子顯微鏡，恒溫箱，高壓鍋，離心機冰箱，電子天平等。

1.5 實驗動物

健康小白鼠（30～35g）50 只，購自中國科學院上海實驗動物中心。

2 方法

2.1 病原分離

將所采病料分別涂片，革蘭氏染色鏡檢，然后分別接種于麥凱恩瓊脂平板和伊紅美蘭瓊脂平板上。37℃ 需氧培養(yǎng) 24 h 后，觀察其生長情況，形態(tài)和顏色，革蘭氏染色，顯微鏡檢查。

2.2 再接種

再接種于血清肉湯，純化后放置 4℃，冷藏備用。

2.3 純化培養(yǎng)

從麥康凱培養(yǎng)基挑取磚紅色單個疑似菌落或從伊紅美蘭培養(yǎng)基上挑取紫黑色、帶金屬光澤閃亮點疑似菌落，接種于普通培瓊脂養(yǎng)基上37℃ 需氧培養(yǎng) 24 h。

2.4 生化試驗

隨機抽取上述分離菌培養(yǎng)物 3#、8#、12#，分別接種于蔗糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖等乳酸糖化管中做乳酸糖化實驗37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察其對糖的利用情況。同時，各菌株做三糖鐵試驗，檸檬酸試驗，甲基紅試驗，V-P試驗，運動力試驗等。

2.5 致病性試驗

將上述生化反應已鑒定為大腸桿菌的疑似菌株，分別接種于普通肉湯37 ℃培養(yǎng)24 h備用，取健康小白鼠隨機分3組，每組3只/珠，另取3只作為對照組；實驗組小白鼠每只腹腔注射0.2ml疑似分離珠肉湯培養(yǎng)液，對照組注射無菌肉湯，兩組隔離觀察飼養(yǎng)，每6 h觀察1次，并做好記錄。

2.6 致病力及保護力試驗

2.6.1 菌落形成單位的測定

（1）將已滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分別倒入已滅菌過的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約 15 ml 培養(yǎng)基，啟開皿蓋暴露于無菌室內(nèi)的不同地方，10 min 后，蓋好皿蓋。（2）將培養(yǎng)皿倒置于 37 ℃培養(yǎng) 24 h后，觀察菌落情況，統(tǒng)計菌落數(shù)。（3）如果每個皿內(nèi)菌落不超過4 個，則可以認為無菌程度良好，菌落數(shù)很多，則應對無菌室進一步滅菌，再重復以上步驟。

2.6.2 致病力試驗

無菌吸取上述血清肉湯培養(yǎng)物（含菌量5.0×108CFU/ml）以0.1 ml/只、0.2 ml/只、0.3 ml/只、0.4 ml /只、0.5 ml/只分別腹腔注射小白鼠 2 只，觀察其死亡時間和數(shù)量，測定其最小致死量。再將上述血清肉湯培養(yǎng)物腹腔注射小白鼠，小白鼠共 12 只，分 6組。第一組，每只小白鼠注射 3# 菌 0.2 ml，第二組每只注射 8#菌0.2 ml，第三組每只注射 3#、8#菌各0.1 ml，第四組每只注射 12#菌 0.2 ml，第五組每只注射 8#.12#菌 各0.1 ml，第六組每只注射無菌血清肉湯 1.0 ml。以上各組分別飼養(yǎng)觀察其死亡時間及數(shù)量。

2.6.3 保護力試驗

將 3#、8#、12#血清肉湯培養(yǎng)物分別接種于 18 cm 瓊脂平板。37 ℃培養(yǎng) 24 h 后，收菌。再用麥氏比濁管比濁，適當稀釋，然后用 0.3% 甲醛滅活，37℃作用 24 h后做無菌檢驗。然后將其分別腹腔接種小白鼠 2只，劑量為 0.4 ml/只。10 d后，再分別進行人工感染，劑量為 0.2 ml/只。

2.6.4 細菌回收試驗

對致病力試驗出現(xiàn)癥狀及死亡小白鼠剖檢，并采集病料，進行分離。

3 結(jié)果

3.1 分離細菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

3.1.1 培養(yǎng)特性

37 ℃培養(yǎng) 24 h 后，所采的 12 份病料在麥康凱瓊脂平板上形成磚紅色圓形隆起、光滑濕潤、邊緣整齊直徑為1.5～2.5mm的小菌落，伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上形成紫黑色、帶金屬光澤閃亮點菌落。在普通培養(yǎng)基上易于生長，形成光滑、濕潤、灰白色菌落，對碳水化合物發(fā)酵能力強。

3.1.2 形態(tài)學觀察

小腸內(nèi)容物培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查為革蘭氏陰性兩端鈍圓中等大小桿菌，多單在，偶有兩、三個連在一起，有鞭毛，無芽孢。根據(jù)以上特征可初步判斷為豬大腸桿菌。

3.2 生化試驗結(jié)果

全部菌株均能迅速分解葡萄糖與甘露醇（產(chǎn)酸），2%的菌株只產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣，一般分解甘露醇的產(chǎn)氣量比分解葡萄糖的產(chǎn)氣量要多。90%以上的菌株分解阿拉伯糖、麥芽糖、乳糖一般都在24h內(nèi)分解，90%以上的菌株不分解福壽草醇和肌醇。

3.3 致病力試驗結(jié)果

實驗組在腹腔注射12h后十組小白鼠均出現(xiàn)不同程度的精神沉郁，被毛臟亂，反應遲鈍，6h后開始出現(xiàn)陸續(xù)死亡，3組在6～24h內(nèi)死亡其余7組在24～48h內(nèi)全部死亡，對照組在72h后繼續(xù)健康存活，無菌操作取病死小白鼠肝、脾涂片鏡檢為革蘭氏陰性桿菌，將病料接種肉湯收獲到與攻毒組相同的特征的大腸桿菌，對照組全部健康存活，以此說明此次分離的大腸桿菌對小白鼠都有不同程度的致病作用，其中，有三組致病力較強。

3.4 保護力試驗結(jié)果

經(jīng)觀察接種后的三組小白鼠，48h有一組發(fā)病，但癥狀輕微經(jīng)過良好，其他兩組72 h均健康存活，無臨床癥狀，由此其保護力效果明顯。

3.5 細菌回收試驗結(jié)果

將上述死亡及發(fā)病的小白鼠剖檢采集病料，進行細菌分離、生化試驗及血清學鑒定，能得到原分離菌。

4 分析和討論

4.1 病原體

本研究對我們本地區(qū)發(fā)病豬群的病料進行了細菌分離鑒定，結(jié)果判定為大腸桿菌，并證明該豬群為豬大腸桿菌感染引起的豬大腸桿菌病，且毒力較強。藥敏試驗結(jié)果表明，該菌株對不同的藥物敏感性存在一定的差異，但總體來說，對其敏感的藥物較多。

4.2 試驗動物

通過動物攻毒試驗發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對小白鼠具有較強的致病作用：小白鼠的發(fā)病率為100%，死亡率100%。當然，不同血清型的致病力也有可能隨著發(fā)病地區(qū)、豬群品種等的不同而存在差異。一周齡以內(nèi)的初生仔豬感染時多呈急性腸炎，腹瀉，排黃色液狀糞便、死亡迅速、發(fā)病率、死亡率很高；10至30日齡感染時，表現(xiàn)為突然發(fā)生腹瀉排出乳白色或灰白色糊狀糞便且腥臭粘膩，雖死亡率不高，但容易形成僵豬。

4.3 防治

血清學鑒定結(jié)果顯示所分離菌株為大腸桿菌，對該株大腸桿菌血清學試驗鑒定已鑒定出型，但不同地區(qū)又有不同的血清型，同一地區(qū)不同豬群的血清型可能相同也可能不同。由于大腸桿菌不同血清型之間的交叉保護率低，因此，針對不同發(fā)病地區(qū)應選擇與該地區(qū)相對應的血清型或含有相同血清型的豬大腸桿菌疫苗（即單一或多價疫苗）進行免疫預防接種，才能起到有效的預防效果。

4.4 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果證明，本次分離到的大腸桿菌對多種藥物具有很強的敏感性。本次檢查結(jié)果看耐藥性較高的抗生素主要是獸醫(yī)臨床使用率較高的喹唑酮類、青霉素類、氯霉素類等，這可能由于豬場疾病的原因大量使用這些藥物進行藥物預防或在飼料中長期大量添加抗生素，由此提示臨床上盡量避免使用此類藥物，可使用多粘菌素、呋喃類藥物，這可能與豬場在臨床上不經(jīng)常使用這些藥物有關(guān)。

綜上所述，本研究試驗結(jié)果對疑似豬大腸桿菌病進行了確切診斷，并為有效防治該病提供了科學依據(jù)和有利條件，對指導養(yǎng)殖生產(chǎn)具有重要意義和應用價值。由此也可以說明在我區(qū)的部分中小型豬場中因長期濫用抗生素已經(jīng)產(chǎn)生較為嚴重的后果，導致耐多種藥物及耐藥譜相似的菌種在快速增加，對今后豬場在應對此類疫病診治提供具有一定的臨床參考價值。

[1]李健強.獸醫(yī)微生物學實驗與實習指導[D].西北農(nóng)業(yè)大學，2016

[2]張彥明，賈靖國，劉安典.動物性食品衛(wèi)生檢驗技術(shù)[M].西北大學出版社，1999.