豬精液體外低溫保存技術(shù)新進(jìn)展

李新紅，李步社

（1．上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；2．上海祥欣畜禽有限公司，上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201302）

豬精液體外低溫保存技術(shù)新進(jìn)展

李新紅1*，李步社2

（1．上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；2．上海祥欣畜禽有限公司，上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201302）

伴隨豬聯(lián)合育種的開展及人工輸精技術(shù)的推廣運(yùn)用，豬精液低溫保存技術(shù)已成為研究的熱點(diǎn)。精液低溫保存是通過降低或抑制精子新陳代謝、維持精子質(zhì)膜及頂體結(jié)構(gòu)完整性，延長精子體外存活時間。主要包括：液氮超低溫（-196 ℃）冷凍保存、4～5 ℃低溫“冷休克”保存以及15～17 ℃鮮精體外保存。早期研究主要集中在低溫保護(hù)劑和技術(shù)方法的篩選與優(yōu)化，對豬精液低溫保存進(jìn)行了深入探索。近年來，有關(guān)豬精液低溫保存過程中抑制豬精子低溫?fù)p傷、延長精子的存活壽命及提高精子的受精能力等研究取得突破性進(jìn)展。該文就近年來不同保存技術(shù)、保護(hù)劑及未來重點(diǎn)解決的問題進(jìn)行簡要概述，旨在為開展相關(guān)研究以及實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論參考。

豬精液；低溫保存；人工輸精

0 前言

生態(tài)環(huán)境壓力、飼料成本、疾病防控、國際市場競爭以及市場波動等諸多因素制約著我國生豬規(guī)模化養(yǎng)殖的發(fā)展。尤其是“十三五”期間國家生豬養(yǎng)殖“約束發(fā)展區(qū)”的規(guī)劃實(shí)施，推進(jìn)生豬改良及聯(lián)合育種，加快生豬養(yǎng)殖業(yè)轉(zhuǎn)型升級是破解制約當(dāng)前產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。豬人工輸精技術(shù)及豬精液體外保存是生豬聯(lián)合育種的前提基礎(chǔ)，豬精液體外保存期較短、精液中病原菌的存在成為阻礙限制生豬改良及實(shí)施聯(lián)合育種的兩大主要因素，在一定程度上限制生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。優(yōu)質(zhì)種豬精液體外保存方式主要采用液氮超低溫（-196℃）冷凍保存、4～5℃低溫“冷休克”保存以及15～17℃鮮精體外保存。目前，生豬養(yǎng)殖業(yè)中主要利用新鮮精液人工輸精繁殖為主，但所使用的鮮精液體外保存的時間一般不超過3 d，鮮精體外保存時間短且精子質(zhì)量下降較快，極大影響公豬精液的利用效率，致使公豬保有量增加，影響?zhàn)B殖的經(jīng)濟(jì)效益，故限制生豬改良及聯(lián)合育種的推進(jìn)。因此，構(gòu)建豬精液體外超低溫冷凍保存長期保存體系及4～5℃低溫“冷休克”保存體系，提高優(yōu)質(zhì)種公豬利用率是當(dāng)前生豬養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的問題。本文對近五年來豬精液體外低溫保存技術(shù)相關(guān)研究進(jìn)行簡要概述。

1 超低溫冷凍保存技術(shù)進(jìn)展

超低溫冷凍是豬精液體外保存常用的技術(shù)之一，然而過去一直處于瓶頸狀態(tài)，其原因主要是豬精子質(zhì)膜中富含不飽和脂肪酸，極易受到冷凍應(yīng)激傷害失去穩(wěn)定性和選擇通透性，Ca2+、和稀釋液中的一些成分進(jìn)入精子內(nèi)，擾亂精子生理平衡，促使蛋白質(zhì)和mRNA降解，導(dǎo)致凍融精子質(zhì)膜、頂體及核的穩(wěn)定性遭到破壞，線粒體功能和精子活力及存活率顯著降低，人工授精妊娠率及窩產(chǎn)仔數(shù)均有所降低[1]。因此，2013年以前世界上應(yīng)用豬冷凍精液進(jìn)行人工授精的母豬量不到1%[2]。近年來，超低溫冷凍保存技術(shù)取得快速發(fā)展，稀釋防凍保護(hù)劑的改進(jìn)、冷凍及解凍速率優(yōu)化、乳化劑及抗氧化劑的運(yùn)用，豬凍融精子頂體、質(zhì)膜結(jié)構(gòu)完整性及核遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性均得到顯著提高，豬凍精繁殖效率已經(jīng)達(dá)到甚至略優(yōu)于鮮精指標(biāo)。

卵黃和乳糖是最常用的豬冷凍精子非滲透性保護(hù)劑，免受精子低溫應(yīng)激傷害，阻止Ca2+內(nèi)流。一些高分子化合物（如：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇和葡聚糖）亦提高冷凍保護(hù)作用。甘油、二甲亞砜（DMSO）、乙烯、甲醇、丙烯和二甲基乙酰胺是豬冷凍精子滲透性保護(hù)劑，其中甘油適宜濃度為2%～3%。非滲透性冷凍保護(hù)劑作用于細(xì)胞外，同時可以提高滲透性保護(hù)劑的保護(hù)性能[3]。如主成分十二烷基磺酸鈉的Orvus ES Paste，一種表面活性劑，促進(jìn)卵黃蛋白和精子質(zhì)膜的相互作用。冷凍程序也有進(jìn)一步優(yōu)化，尤其是兩步降溫法保存以及麥細(xì)管于40 ℃水浴中解凍等程序的優(yōu)化顯著提高凍融精子的活力等宏觀指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)證明，添加50%精清的保護(hù)效果優(yōu)于添加10%的精清。豬精子在超低溫冷凍保存過程中除受到低溫機(jī)械損傷外，還要遭受ROS等自由基的氧化損傷。因此，抗氧化劑是豬精子超低溫冷凍保存技術(shù)中常用的成分。近年來研究證實(shí)，冷凍稀釋液中添加抗氧化劑可以增加凍融精子的質(zhì)量以及人工授精后的繁殖效率。然而，并非所有的抗氧化劑都能提高豬凍融精子的質(zhì)量及受精潛能。研究顯示，還原性谷胱甘肽、L-半胱氨酸、α-生育酚、丁基苯甲醇和維生素C對于超低溫冷凍保存豬精子是較為有效的抗氧化劑。此外，抗氧化劑的結(jié)合使用能夠有效提高凍融精子人工輸精的產(chǎn)仔數(shù)，例如維生素C結(jié)合還原型谷胱甘肽共同使用，能有效提高豬凍融精子的質(zhì)量。

此外，輔助保護(hù)劑以及子宮深度輸精技術(shù)有利于提高凍精的繁殖效率。丹參多糖、丁羥甲苯、前列腺素F2α以及咖啡因與氯化鈣的聯(lián)合使用顯著提高凍融精子的活力；含一定量膽固醇的環(huán)糊精（CLCs）有利于增強(qiáng)凍融精子的抗凍性，尤其是用來提高凍融質(zhì)膜中膽固醇的豐度及精子的質(zhì)膜完整性。人工輸精主要包括傳統(tǒng)體內(nèi)或者子宮頸內(nèi)輸精、子宮內(nèi)輸精以及子宮內(nèi)深度輸精3種方式，繁殖生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)子宮內(nèi)深度輸精適合豬凍精繁殖生產(chǎn)。盡管在豬精液冷凍保存技術(shù)方面取得顯著成績，受胎率及產(chǎn)仔數(shù)已經(jīng)達(dá)到甚至略高于鮮精繁殖指標(biāo)。然而，國內(nèi)外豬凍精繁殖生產(chǎn)存在的共性問題是受限于制備凍精的鮮精液質(zhì)量，活力低于0.8的精液不利于制備凍精，因而限制了種公豬精液的凍精制備利用率，這也是未來研究需要解決的主要問題。

2 4～5 ℃低溫“冷休克”保存技術(shù)進(jìn)展

相對于液氮超低溫冷凍保存，4～5 ℃低溫“冷休克”保存能有效減少液氮冷凍所產(chǎn)生的機(jī)械損傷，同時能有效節(jié)約生產(chǎn)成本。同時，低溫“冷休克”精子代謝水平低于37℃條件下的代謝水平，能有效緩解精子能量的消耗。生產(chǎn)運(yùn)輸成本和操作技術(shù)與常溫精液基本相同，有效提高優(yōu)良種畜利用率及聯(lián)合育種的推廣，具有很廣的應(yīng)用前景。過去豬精液體外保存相關(guān)研究主要集中于液氮超低溫冷凍保存和鮮精15～17 ℃保存，而4～5 ℃低溫保存研究較少。近年來，大多數(shù)研究主要集中于精液4～5 ℃保護(hù)劑的篩選、代謝調(diào)控以及抗氧化劑的篩選[4]。其中糖代謝是家畜精子能量的主要來源之一，而葡萄糖、果糖及蔗糖是常用的保護(hù)劑成分，亦是主要能量來源物質(zhì)。盡管不同稀釋液的研究試驗(yàn)方法和使用效果不同，其組成主要由葡萄糖、果糖、檸檬酸（鈉）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化鈣、碳酸氫鈉等成分構(gòu)成，作用包括營養(yǎng)、pH調(diào)控、緩沖性、滲透壓和低溫保護(hù)性能等。目前，脫脂奶粉的加工工藝已經(jīng)達(dá)到先進(jìn)水平，有害細(xì)菌數(shù)已完全符合世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)，所以較多研究者傾向于向精液稀釋液中添加脫脂奶粉。Pagl等(2006)研究證實(shí)，在精液4～5 ℃保存添加脫脂奶粉可以有效維持精子活力約兩周，甚至在4～5 ℃條件下保存豬精液脫脂奶粉的效果要優(yōu)于全乳，故脫脂奶粉在豬精液稀釋液中的應(yīng)用更加廣泛。研究證實(shí)，牛奶中的乳鐵傳遞蛋白對維持精子活力、運(yùn)動能力和獲能發(fā)揮重大作用。此外，添加奶類物質(zhì)可以降低精液中電解質(zhì)濃度，調(diào)節(jié)精液滲透壓，從而保護(hù)精子質(zhì)膜的完整性及線粒體的活性。精子代謝過程中相應(yīng)酶活性是代謝信號通路激活的關(guān)鍵，尤其是GAPDH、AMPK的活性以及線粒體活性直接調(diào)控精子代謝過程。因此，2～5 ℃低溫“冷休克”保存過程中，豬精子酶活性以及線粒體活性的維持對復(fù)蘇后精子的活力及壽命起到至關(guān)重要作用。

此外，精子體外保存過程中的活力降低與精液中富集的活性氧離子（ROS）密切相關(guān)。豬精子質(zhì)膜中含有高濃度的不飽和脂肪酸，極易發(fā)生氧化損傷，病理水平下ROS導(dǎo)致精子質(zhì)膜發(fā)生氧化應(yīng)激[5]。因此，精液稀釋液中添加抗氧化物質(zhì)尤為重要，能減少精子細(xì)胞內(nèi)多余的ROS生成量，抵抗ROS造成的氧化壓力，提高精子自身的抗氧化特性，維持精子活力，延長體外保存時間。常見的抗氧化劑包括酶類抗氧化劑（如：過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等）和非酶類抗氧化劑（如：維生素C、維生素E、半胱氨酸）等。研究證明，不同抗氧化劑的使用對于豬精子體外4～5 ℃保存均有積極效應(yīng)。目前，4～5 ℃低溫“冷休克”保存豬精子的存活時間能達(dá)到10 d，活力能夠維持在0.5以上。但尚無4～5 ℃低溫條件保存的豬精子人工輸精后母豬受胎率、產(chǎn)仔數(shù)等繁殖指標(biāo)報道。

3 鮮精15～17 ℃保存技術(shù)進(jìn)展

鮮精體外15～17 ℃保存是國內(nèi)外現(xiàn)普遍采用的豬精液保存技術(shù)方法，其人工輸精繁殖效率與自然交配繁殖相似。然而體外保存時間相對較短，有效利用期不超過5 d，因而極大限制鮮精的利用率。隨著養(yǎng)豬業(yè)人工授精技術(shù)的發(fā)展，對豬精液15～17 ℃條件保存所用的稀釋劑成分及添加物提出更高要求，尤其是強(qiáng)化精子宏觀指標(biāo)檢測，準(zhǔn)確反映精子有效存活期及質(zhì)量特性，為指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。近年來，研究重點(diǎn)主要集中在稀釋劑成分及抗氧化劑的篩選，除常規(guī)使用的葡萄糖、檸檬酸（鈉）、氯化鈣、碳酸氫鈉及三羥甲基氨基甲烷（Tris）等稀釋劑成分之外，BSA、脫脂奶粉及環(huán)糊精等成分亦用作豬精液15～17 ℃保存稀釋劑成分，能有效提高豬精子體外保存的活力參數(shù)指標(biāo)，延長精子存活壽命，使保存的豬精液有效利用期增至5 d以上，顯著提高優(yōu)質(zhì)種公豬精液的利用率。Fu等（2017）利用超聲處理過的脫脂奶粉，17 ℃保存豬精液7 d后，精子GAPDH活性、線粒體膜電位及ATP含量顯著高于對照組，添加BSA及脫脂奶粉的處理組能有效抑制豬精子蛋白的脫磷酸化及乙?；痆6]。Carla等（2017）利用蔗糖及糖分解酶17 ℃保存豬精液，保存10 d后能顯著提高精子活力、前向性運(yùn)動、質(zhì)膜完整性以及頂體完整性。選取135頭母豬進(jìn)行生產(chǎn)性實(shí)驗(yàn)，受孕率及產(chǎn)仔率分別為97.8%、96.3%，證實(shí)添加蔗糖及糖分解酶能夠滿足17 ℃保存過程中豬精子的代謝需求[7]。

過氧化損傷是精子體外保存過程中誘導(dǎo)活力降低重要因素之一。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽、維生素C及維生素E、?；撬?、硫辛酸等是超氧化物和過氧化氫的抗氧化劑，添加抗氧化劑能有效提高精子的抗氧化損傷能力。Li等（2017）在豬精液稀釋液中添加不同濃度的?；撬犸@著提高17℃精子的活力、存活時間及抗氧化能力，保存7 d后精子活力達(dá)到0.5以上；Zhang等（2016）在稀釋劑中添加5 mmol/L谷胱甘肽，能有效延長豬精子17℃保存的存活時間，顯著提高精子活力、質(zhì)膜及頂體完整性、抗氧化能力（T-AOC），降低MDA及H2O2水平[8]。Zhang等（2016）在稀釋劑中添加不同濃度的超氧化物歧化酶（SOD），其中濃度200 U/mL SOD處理組精子活力、質(zhì)膜完整性及頂體完整性、T-AOC顯著提高，MDA與H2O2水平顯著降低[8]。Fang等（2017）研究證實(shí)，稀釋劑中添加80μM碘甲硫氨酸(IM)17℃保存6 d后，精子活力、質(zhì)膜及頂體完整性沒有顯著變化，但80μM碘甲硫氨酸組產(chǎn)仔數(shù)明顯高于對照組，且能有效抑制豬精液中變形菌、葡萄球菌等細(xì)菌微生物的擴(kuò)繁。

4 豬精液中病原微生物的影響及應(yīng)對措施

豬精子中不飽和脂肪酸含量高致使其對低溫?fù)p傷較為敏感是限制豬精液低溫保存技術(shù)發(fā)展的一個主要因素。除此之外，豬精液普遍存在的細(xì)菌、病毒等病原微生物亦是影響豬精液低溫保存宏觀指標(biāo)的又一大限制性因素。研究證實(shí)，豬精液中含有50多種細(xì)菌微生物，如大腸桿菌、變形桿菌、沙雷菌、腸桿菌、克雷伯菌、葡萄球菌、鏈球菌和假單胞菌等[1]。無論是17 ℃保存，還是4～5 ℃低溫保存，均會對精子活力、成活率、質(zhì)膜及頂體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的破壞作用[9]。豬精液中細(xì)菌等微生物部分屬于內(nèi)源性，來自于公豬的包皮、尿道、外生殖器及泌尿生殖感染等因素均可能導(dǎo)致精液被細(xì)菌污染，而多數(shù)來自采精器具、稀釋液及保存環(huán)境等人為過程中缺乏相應(yīng)的衛(wèi)生條件，尤其高溫季節(jié)病原菌的滋生以及耐藥性病原菌的產(chǎn)生，是精液中病原菌防控的難題，而傳統(tǒng)病原菌防控策略已經(jīng)無法滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。低溫保存過程中細(xì)菌等病原菌對豬精子質(zhì)量產(chǎn)生較大的影響，主要體現(xiàn)誘導(dǎo)精子發(fā)生凝集現(xiàn)象[10]，降低精子運(yùn)動參數(shù)等質(zhì)量特性，誘發(fā)破壞精子頂體完整性，抑制精子特異性蛋白質(zhì)磷酸化水平[11]，降低精液pH以及母豬產(chǎn)仔數(shù)等生產(chǎn)性能[12]。豬精液中細(xì)菌菌落濃度一般為103～105cfu/mL，而菌落濃度大于103cfu/mL時會對精子質(zhì)量造成不良影響。有關(guān)細(xì)菌與豬精子質(zhì)量的研究常用商用菌種作為實(shí)驗(yàn)材料，而這些菌株一般具有高致病性，無法準(zhǔn)確評估精液中細(xì)菌對豬精子的影響。目前家畜精液中病原菌的存在已經(jīng)引起國外飼養(yǎng)業(yè)廣泛重視，美國、法國、加拿大及巴西等國家陸續(xù)開展家畜動物精液中細(xì)菌等微生物病原菌的防控研究，尤其抗生素耐藥菌的種類篩選、防治以及致病機(jī)理方面已經(jīng)取得初步成效，為進(jìn)一步開展精液中病原菌的防治研究以及相關(guān)新產(chǎn)品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，豬精液低溫保存技術(shù)有所突破，尤其是保護(hù)劑成分的篩選、優(yōu)化以及抗氧化損傷方面取得突破性進(jìn)展。然而，豬精液中病原菌的存在、高溫季節(jié)精子質(zhì)量顯著降低等限制性因素影響低溫保存精子質(zhì)量，豬精液低溫保存技術(shù)尚需進(jìn)一步改進(jìn)提高，未來相關(guān)研究重點(diǎn)主要聚焦以下幾方面：一是液氮超低溫冷凍保存技術(shù)在原有保護(hù)劑成分基礎(chǔ)上尚需進(jìn)一步優(yōu)化，維持凍融精子結(jié)構(gòu)完整性及精子膜通透性，維持精子中關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)及修飾的生物學(xué)功能，克服凍精繁殖效率低的瓶頸，提高活力相對較低的精液凍精利用率；二是在糖代謝及氧化磷酸化生理調(diào)控基礎(chǔ)上，有效延長精子低溫體外保存時間，深入了解和揭示低溫保存過程精子活力降低的分子機(jī)理，建立4～5 ℃豬精液體外保存技術(shù)體系；三是新鮮精液15～17 ℃保存過程中細(xì)菌等病原微生物的防控研究，開展家畜精液病原微生物多樣性分析、感染家畜動物精子的致病機(jī)理以及綜合防治研究，制定家畜動物精液病原菌安全標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建家畜動物病原菌的防控體系，擴(kuò)大養(yǎng)殖企業(yè)生存和發(fā)展空間，實(shí)現(xiàn)地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)加快轉(zhuǎn)型升級及可持續(xù)循環(huán)發(fā)展是目前亟待解決的問題。通過結(jié)合低溫生物學(xué)的相關(guān)知識及對精子低溫?fù)p傷分子機(jī)理探索，可為豬精液低溫存研究提供理論指導(dǎo)，最終提高優(yōu)質(zhì)種公豬的高效利用率及繁殖效率。

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上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目：滬農(nóng)科基字（2014）第2-5號；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目：31772594

2017-09-26）