豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

楊 偉，湯德元，曾智勇，王 彬，黃 濤，胡玲玲，龍冬梅，石遠(yuǎn)菊，葉 麗（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

楊 偉，湯德元*，曾智勇，王 彬，黃 濤，胡玲玲，龍冬梅，石遠(yuǎn)菊，葉 麗（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起豬只的一種高度接觸性胃腸道傳染病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和脫水，該病為影響?zhàn)B豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為法定報(bào)告的B類動(dòng)物疫病。近年來，國(guó)內(nèi)外許多研究者在對(duì)豬傳染性胃腸炎的診斷與檢測(cè)方法上進(jìn)行了大量的研究，并建立了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室診斷檢測(cè)技術(shù)，這些檢測(cè)技術(shù)主要包括病理診斷、病毒的分離鑒定、電鏡檢測(cè)、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷方法等。本文對(duì)豬傳染性胃腸炎主要的診斷技術(shù)進(jìn)行了綜述，以期為該病在臨床的快速診斷及防控提供參考。

豬傳染性胃腸炎；病原學(xué)；血清學(xué)；分子生物學(xué)；診斷

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起豬只的一種高度接觸性胃腸道傳染病，TGEV破壞小腸上皮細(xì)胞而引起腸絨毛萎縮，該病臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和脫水，對(duì)不同豬種和不同年齡的仔豬都易感，而對(duì)成年豬的危害性相對(duì)較小。該病在1946年由Doyle和Hutchings[1]在美國(guó)首次報(bào)道，隨后在世界許多國(guó)家和地區(qū)相繼報(bào)道了本病的發(fā)生；我國(guó)在20世紀(jì)60年代首次報(bào)道了TGE在我國(guó)的流行；近年來我國(guó)各地不同程度地暴發(fā)了豬傳染性胃腸炎，給生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于豬傳染性胃腸炎（TGE）與豬流行性腹瀉(PED)在臨床癥狀、流行病學(xué)等方面的表現(xiàn)非常相似，給臨床診斷以及防治都帶來了一定困難。因此，掌握TGE檢測(cè)技術(shù)對(duì)該病的診斷和防治均有重要的意義。豬傳染性胃腸炎的實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括病理診斷、病毒的分離鑒定、電鏡檢測(cè)、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷方法，現(xiàn)就這些診斷技術(shù)的研究進(jìn)展綜述如下。

1 TGE的臨床及病理診斷

1.1 臨床診斷

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、發(fā)病豬臨床癥狀觀察和病理變化進(jìn)行綜合診斷。TGE臨床癥狀為仔豬突然性嘔吐，水樣腹瀉。開始是灰白色糞便，然后變?yōu)辄S綠色糞便，糞便中夾雜有未消化的凝乳塊，病程較久時(shí)，會(huì)出現(xiàn)脫水。日齡越小，病程越短，死亡率越高，隨著日齡的增長(zhǎng)病死率逐漸降低。仔豬食欲下降，拒食；1日齡內(nèi)新生仔豬發(fā)生腹瀉后3～4 d，呈現(xiàn)嚴(yán)重脫水而死亡，發(fā)病死亡率很高（可達(dá)100%）。保育豬、母豬癥狀輕重不一，其中癥狀輕的，超過3周齡的豬通常能夠自行恢復(fù)，但也影響發(fā)育；母豬患該病會(huì)導(dǎo)致泌乳量減少，因與患病仔豬長(zhǎng)期接觸、反復(fù)感染而發(fā)病嚴(yán)重，體溫升高、嘔吐、腹瀉和厭食；與患病仔豬無接觸的母豬通常僅有輕微癥狀或無癥狀。

1.2 病理剖檢診斷

TGE剖檢的主要病變集中在胃腸道。眼觀從胃到直腸可見程度不一的卡他性炎癥。胃腸充滿凝乳塊，胃黏膜潰爛；小腸充滿氣體，腸壁彈性下降，管壁變薄，呈透明或半透明狀，或有充血、出血及潰瘍等癥狀；腸內(nèi)容物呈泡沫狀、黃色、透明。小腸上皮細(xì)胞大量脫落壞死，腸絨毛變短和萎縮；正常仔豬的空腸中絨毛長(zhǎng)度：利貝昆濾泡的深度比值是7∶1，但是在被感染TGEV的仔豬體內(nèi)這個(gè)比值的大小僅僅約為1∶1；腸絨毛萎縮也常見于輪狀病毒腹瀉，但一般不如TGEV嚴(yán)重[2]。腸系膜淋巴結(jié)腫脹、充血、出血，淋巴管沒有乳糜。心臟，肺臟，脾臟，肝臟，腎臟未見明顯的眼觀病理病變。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病毒的分離鑒定

TGEV的分離鑒定通常用乳豬接種試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)2種方法。用經(jīng)處理的病毒口腔感染仔豬是分離TGEV最敏感的方法，該法只有結(jié)合流行病學(xué)做出初步診斷，不排除有其他病毒感染的可能，且成本、環(huán)境及人員技術(shù)要求較高，因此，常采用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行病毒的分離鑒定。豬腎細(xì)胞（PK15）和豬睪丸細(xì)胞（ST）是實(shí)驗(yàn)室最常用的細(xì)胞。在ST或豬甲狀腺細(xì)胞上的典型細(xì)胞病變現(xiàn)象（CPE），呈現(xiàn)膨脹、圓形或長(zhǎng)形外觀如氣球的細(xì)胞組成。第一次接種細(xì)胞可能沒有明顯的細(xì)胞病變（CPE），往往需經(jīng)連續(xù)盲傳幾代后，才能使細(xì)胞發(fā)生特征性病變。Pocock和Garwes報(bào)道，當(dāng)次代豬甲狀腺細(xì)胞用弱酸性營(yíng)養(yǎng)液時(shí)，TGEV增殖滴度最高。同時(shí)，為了提高病毒對(duì)細(xì)胞的吸附，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加二甲基亞砜（DMSO）等化學(xué)試劑可以明顯提高細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性，從而提高病毒的分離成功率。

2.2 電鏡觀察

用電鏡檢測(cè) TGEV也是常用的診斷方法之一。通過電鏡觀察（EM），病毒多分布在胞漿的空泡里和微絨毛間隙，在微絨毛間的病毒往往呈串球狀排列。電鏡檢測(cè)顯示：除脾臟外，病毒大量分布于病豬的各種器官中，在小腸中含毒量最高。由于TGEV與PEDV等為代表冠狀病毒形態(tài)十分相似，僅僅通過電鏡觀察無法鑒別診斷，免疫電鏡法（IEH）可以更敏感確切地檢測(cè)臨床樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物中的TGEV，并可提供病毒血清學(xué)鑒定。1999年王繼科等[3]利用免疫電鏡（IEH）觀察和分析，從形態(tài)上的細(xì)微差異鑒別TGEV和PEDV，為鑒別這兩種病毒粒子建立了初步診斷意義；江春霞[4]將TGEV細(xì)胞毒接種于原代豬腎細(xì)胞，進(jìn)行超薄細(xì)胞切片電鏡、直接負(fù)染電鏡、免疫電鏡，在電鏡下清晰的觀察到TGEV病毒粒子。

2.3 血清學(xué)診斷

2.3.1 免疫熒光檢測(cè)

熒光抗體檢測(cè)（IFA）TGEV是一種靈敏性和特異都較好的診斷方法；此方法主要從小腸上皮細(xì)胞、腸內(nèi)容物或糞便中檢測(cè)TGEV。馬思奇等[5]用免疫熒光直接法檢查扁桃體應(yīng)用于活體診斷TGEV，提高了檢出率，既適用于早期感染，也適用于慢性或隱性帶毒豬的診斷；趙鑫等[6]用抗TGEV的N蛋白單克隆抗體，為TGEV 檢測(cè)方法的建立和N 蛋白功能的分析奠定了基礎(chǔ)；利用所制備的單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光對(duì)病原檢測(cè)具有較高的特異性，為鑒別診斷TGEV與PRCV（豬呼吸道冠狀病毒）的阻斷ELISA方法的建立打下了前期基礎(chǔ)，為TGEV與PRCV的血清學(xué)診斷提供了材料[7]。朱蘊(yùn)暖等[8]建立了TGEV特異性的間接免疫熒光檢測(cè)法，對(duì)TGEV的實(shí)驗(yàn)室診斷及TGEV在感染細(xì)胞中的定位和動(dòng)態(tài)分布提供了有效的檢測(cè)手段。

2.3.2 中和實(shí)驗(yàn)

中和試驗(yàn)（SN）最早于1969年由Carbrey等人建立，其原理是病毒或毒素與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，失去對(duì)易感細(xì)胞的感染性，被稱為中和試驗(yàn)。中和試驗(yàn)主要用于：1）從待檢血清中檢出抗體，或從病料中檢出病毒，用于診斷傳染性病毒?。?）用抗毒素血清檢查樣品中的毒素或區(qū)分細(xì)菌的毒素類型；3）測(cè)定抗病毒血清或抗毒素效價(jià)；4）新分離病毒的鑒定和分型。中和試驗(yàn)通常采用豬睪丸細(xì)胞系或豬腎細(xì)胞系培養(yǎng)，可作大量細(xì)胞試驗(yàn)，或應(yīng)用微量培養(yǎng)板培養(yǎng)單層細(xì)胞進(jìn)行微量中和試驗(yàn)。TGE病豬的中和抗體通常在感染后7～9 d開始出現(xiàn)，21 d能達(dá)到相當(dāng)水平并逐漸增加，愈后血清的中和抗體持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，試驗(yàn)通常采用病毒定量，血清變量法。董志珍等[9]建立以狗直腸瘤(A72細(xì)胞)進(jìn)行TGEV血清中和試驗(yàn)的方法，證實(shí)了A72細(xì)胞可以準(zhǔn)確清晰地反應(yīng)TGEV感染，其敏感性和準(zhǔn)確性優(yōu)于PK15細(xì)胞，且豬TGE血清中和試驗(yàn)與酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)結(jié)果試驗(yàn)的重復(fù)性較好。

2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是國(guó)際貿(mào)易指定標(biāo)準(zhǔn)診斷TGE方法之一，ELISA具有靈敏性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的一種免疫學(xué)檢測(cè)方法。Carman 等[10]用 B-ELISA 診斷TGE 抗體，可同時(shí)區(qū)分 TGEV 和PRCV的抗體，取得了良好效果。鐘濤等[11]利用重組N蛋白作為診斷抗原，建立了一種快速的TGEV抗體間接ELISA檢測(cè)方法，可用于免疫豬群TGEV的監(jiān)測(cè)和診斷。鄒勇等[12]建立了同時(shí)檢測(cè)和鑒別豬流行性腹瀉病毒、TGEV和輪狀病毒抗體的ELISA技術(shù)。姜騫等[13]將重組TGEV的N基因利用大腸埃希氏菌進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)Ni-NAT層析柱純化獲得N蛋白，以該蛋白制備抗原，建立了Dot-ELISA診斷技術(shù)，用肉眼即可判定結(jié)果， 無需特殊設(shè)備條件，快速簡(jiǎn)便， 適合基層進(jìn)行抗體檢測(cè)。

2.4 分子生物學(xué)診斷方法

2.4.1 RT-PCR診斷

RT-PCR成為一種應(yīng)用非常普遍、特異、敏感的檢測(cè)方法，可從微量的核酸樣品中檢測(cè)出RNA序列，根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果和預(yù)測(cè)的核酸分子量大小對(duì)比，可以判定檢測(cè)樣品中是否有TGEV的存在，優(yōu)于傳統(tǒng)的血清學(xué)和免疫學(xué)方法。RT-PCR技術(shù)能快速檢測(cè)感染組織中的豬傳染性胃腸炎病毒。Woods等 ( 1997年) 建立了TGEV的RT- PCR 檢測(cè)技術(shù)，結(jié)果證實(shí) RT- PCR是一種非常特異、敏感的診斷方法。李軍等[14]建立了檢測(cè)TGEV的RT- PCR方法，可檢出l pg的TGEV RNA含量。趙雯雯等[15]利用國(guó)內(nèi)外已發(fā)表TGEV和PEDV基因序列和相關(guān)RT-PCR方法，根據(jù)TGEV的S基因和PEDV的S基因各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性通用引物，建立了TGEV和PEDV二聯(lián)RT-PCR檢測(cè)方法，為TGEV和PEDV的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。沈海蛾等[16]應(yīng)用套式PCR檢測(cè)和區(qū)分TGEV和PRCV的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該種方法特異性強(qiáng) ，能夠區(qū) 分 PRV、PRCV、PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV和PPV等多種病毒。

2.4.2 多重RT-PCR技術(shù)

多重 PCR可用于同時(shí)檢測(cè)兩種或兩種以上的病毒，具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性。多重PCR法是采用多對(duì)引物，在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增多種靶序列，解決了逐一分離每個(gè)待測(cè)樣品中病毒的問題。Jung等[17]為了增強(qiáng)鑒別診斷 PEDV和TGEV方法的靈敏性，在多重 RT-PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上建立了斑點(diǎn)雜交技術(shù)。Kim O和Choi C[18]用改進(jìn)的多重 RT-PCR方法來區(qū)分PEDV和TGEV，在 RT-PCR反應(yīng)體系中分別加入了針對(duì)TGEV和PEDV基因特定保守區(qū)域的兩對(duì)引物，兩者通過 RTPCR 反應(yīng)的產(chǎn)物分別為412個(gè)bp和612個(gè)bp的 DNA目的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳可以鑒別PEDV和TGEV。2010年張坤和何啟蓋[19]建立了能同時(shí)檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬A群輪狀病毒(GAR)的多重RT-PCR檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)PEDV、TGEV、GAR的敏感性分別為92%、100%、100%， 特異性均為100%。該方法敏感性高、特異性強(qiáng)， 具有較高的實(shí)用價(jià)值， 可應(yīng)用于臨床鑒別診斷， 也為這3種病毒性腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

2.4.3 熒光定量RT-PCR技術(shù)

近些年來熒光定量 RT-PCR得到越來越多的應(yīng)用，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。董玲娟等[20]根據(jù)TGEV的N基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增目的片段，構(gòu)建質(zhì)粒，對(duì)熒光定量的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了TGEV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，該方法的特異性高、重復(fù)性好、敏感性比普通PCR檢測(cè)方法高2個(gè)數(shù)量級(jí)，可以對(duì)TGEV進(jìn)行快速檢測(cè)。肖文[21]選擇TGEV的N蛋白基因突變小的區(qū)域，設(shè)計(jì)引物并克隆出陽性標(biāo)準(zhǔn)品，并通過得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的熒光定量RT-PCR方法，該方法能夠檢測(cè)出最低的TGEV的DNA含量為1.445×10-6ng/μL，與常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行比較，得到該方法的敏感性比常規(guī)RT-PCR方法要高出約100倍。與常規(guī) RT-PCR相比，熒光定量RT-PCR特異性更強(qiáng)、敏感性更高，假陽性率低，不易污染，且擴(kuò)增與檢測(cè)一步完成，不需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳等后期處理，操作更簡(jiǎn)便。

2.4.4 限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)

RFLP 是一種區(qū)分具有抗原相關(guān)性病毒的試驗(yàn)方法，把抗原性相近的病毒核酸用特定的限制性內(nèi)切酶酶切，通過對(duì)酶切的產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而區(qū)分被檢病毒核酸。Kwon HM和Saif LJ等[22]對(duì)TGEV和PRCV核酸的差異性進(jìn)行了分析，證明了在某些特定區(qū)域的堿基變化與該分離株的毒力強(qiáng)弱相關(guān)。Jackwood DJ和 Kwon HM[23]將TGEV的RT-PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Sau3AI進(jìn)行酶切，然后對(duì)S基因5′端的酶切圖譜進(jìn)行分析比較，得出的結(jié)論是該酶可將TGEV分成四個(gè)組，幾種限制性內(nèi)切酶聯(lián)合使用，通過對(duì)酶切圖譜的分析可以區(qū)分出TGEV的Purdue株和Miller株。

2.4.5 核酸探針技術(shù)

目前，己建立了用核酸探針雜交技術(shù)檢測(cè)糞便樣品、感染組織或感染細(xì)胞中的TGEV，用這些探針可區(qū)別不同TGEV毒株。曹三杰等[24]用PCR擴(kuò)增制備TGEV的靶基因并進(jìn)行純化，經(jīng)過系列參數(shù)的對(duì)比篩選，選擇構(gòu)建檢測(cè)芯片的最適靶基因，進(jìn)行基因芯片探針最佳標(biāo)記方法試驗(yàn)，取得了較好效果。

2.4.6 原位雜交技術(shù)

原位雜交是在研究DNA分子復(fù)制原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。原位雜交利用標(biāo)記的已知核酸探針，在組織、細(xì)胞及染色體上檢測(cè)特異的 DNA或RNA序列。原位雜交使用的核酸探針可以是放射性探針（如32P標(biāo)記），也可以是非放射性探針（如地高辛標(biāo)記）。Sirinarumitr T等[25]使用了含有TGEV S基因部分序列的兩種質(zhì)粒，成功檢測(cè)了接種于細(xì)胞培養(yǎng)物上和自然感染病變肺臟組織中的TGEV和PRCV。

自1946年TGE發(fā)現(xiàn)并報(bào)道至今，豬傳染性胃腸炎仍然在全世界各個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究，并得出了許多關(guān)于TGEV診斷技術(shù)的成果，越來越多的診斷技術(shù)應(yīng)用于TGEV的診斷。在眾多的診斷技術(shù)中，在診斷上具有各自方法的優(yōu)點(diǎn)，但是在這些診斷技術(shù)中都有著其各自的局限性，因此要根據(jù)試驗(yàn)的目的要求，并結(jié)合具備的條件選擇適宜的檢測(cè)方法對(duì)豬傳染性胃腸炎進(jìn)行診斷。進(jìn)一步開展TGEV診斷方法的研究是有必要的，實(shí)現(xiàn)診斷方法的便捷化、快速化和診斷試劑的商品化，同時(shí)，應(yīng)將各種診斷方法有機(jī)結(jié)合起來，取長(zhǎng)補(bǔ)短，以期達(dá)到最佳的檢測(cè)結(jié)果，為及時(shí)和快速檢測(cè)豬傳染性胃腸炎，為本病的綜合防治提供技術(shù)保障，以減少本病造成的經(jīng)濟(jì)損失，為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展提供有力支持。

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貴州省2017年農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目資助(黔科合支撐[2017]2579號(hào))

楊偉(1993-)，男，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)的科研學(xué)習(xí)

*通訊作者：湯德元（1964-），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)和中西獸醫(yī)結(jié)合的教學(xué)科研工作。E-mail:tdyuan@163.com

2017-09-05）