實(shí)驗(yàn)動物麻醉劑使用的福利倫理問題研究進(jìn)展

李 丹，郭玉瑩，鄧 昊，高 珊，徐士欣

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，天津 300381)

研究進(jìn)展

實(shí)驗(yàn)動物麻醉劑使用的福利倫理問題研究進(jìn)展

李 丹，郭玉瑩，鄧 昊，高 珊，徐士欣*

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，天津 300381)

在進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)時需要選擇合適的麻醉劑來保證實(shí)驗(yàn)操作的順利進(jìn)行，獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時又將實(shí)驗(yàn)動物所遭受的痛苦降至最低，保證實(shí)驗(yàn)動物的福利。近年來，關(guān)于實(shí)驗(yàn)動物的福利倫理問題已越來越引起人們的關(guān)注。本文主要對動物實(shí)驗(yàn)常用的麻醉劑(包括吸入性麻醉劑：乙醚、七氟烷、異氟烷，非吸入性麻醉劑：戊巴比妥鈉、水合氯醛、氯胺酮、烏拉坦)的選擇及使用過程中可能存在的福利倫理問題做一綜述。

實(shí)驗(yàn)動物；麻醉藥物；動物倫理

在進(jìn)行科學(xué)研究的過程中，動物實(shí)驗(yàn)是一種重要的研究手段。在動物實(shí)驗(yàn)中，有效的麻醉不僅是保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行方法學(xué)上的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是保證實(shí)驗(yàn)動物福利的一項(xiàng)基本要求。如何根據(jù)科研目的采用合適的實(shí)驗(yàn)動物并選擇恰當(dāng)?shù)穆樽硭幬锸琼樌M(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)的重要前提。例如在廣泛應(yīng)用的腦缺血再灌注損傷動物模型：大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中，麻醉劑的選擇就是模型制備中的一個重要因素，麻醉劑使用不當(dāng)不但會影響模型制備是否成功，而且可能給實(shí)驗(yàn)動物帶來不必要的痛苦，甚至造成實(shí)驗(yàn)動物死亡。理想的麻醉應(yīng)該既要保證實(shí)驗(yàn)操作順利進(jìn)行，保證獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，又要將實(shí)驗(yàn)動物遭受的痛苦降至最低，保證動物福利要求。本文將對國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)動物麻醉劑使用過程中的福利倫理問題現(xiàn)狀做一綜述，以期為相關(guān)科研工作者更好地進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)提供幫助。

1 國外動物福利倫理研究進(jìn)展

1959年，英國的動物學(xué)家William Russell和生物學(xué)家Rex Burch在《人道主義實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理》(ThePrinciplesofHumaneExperimentalTechnique)一書中首次提出了著名的“3R”原則(the 3R principles)：替代(replacement)、減少(reduction)、優(yōu)化(refinement)[1]。替代：是指盡可能采用其他方法而不使用動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，或者優(yōu)先使用低等動物而非高等動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。減少：是指在不影響科研目的實(shí)現(xiàn)的情況下，盡可能地減少實(shí)驗(yàn)動物的使用數(shù)量。優(yōu)化：是指通過改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線，避免或減輕對實(shí)驗(yàn)動物造成的痛苦。1965年，Brambell提出動物福利的五大自由：享受不受饑渴的自由；享有生活舒適的自由；享有不受痛苦、傷害和疾病的自由；享有生活無恐懼和無悲傷的自由；享有表達(dá)天性的自由。3R原則和動物福利的五大自由構(gòu)成了現(xiàn)在國際上比較公認(rèn)的動物倫理審查的基本要求[2]。

關(guān)于動物麻醉倫理方面，美國獸醫(yī)學(xué)會(American Veterinary Medical Association，AVMA)制定了“動物安樂死指南”(AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition)，提供了可以參考的安樂死方法。2014年7月8日，美國通過了《美國獸醫(yī)流動法案》，這項(xiàng)法案中規(guī)定，為了保護(hù)動物福利，獸醫(yī)可在緊急情況下對動物進(jìn)行麻醉、疼痛管理甚至安樂死。

2 國內(nèi)動物福利倫理研究進(jìn)展

國內(nèi)在動物倫理方面的工作起步相對較晚。1988年國家科學(xué)技術(shù)委員會發(fā)布了《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》，要求相關(guān)工作人員必須愛護(hù)實(shí)驗(yàn)動物；2006年科技部頒布了《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》，從飼養(yǎng)管理、應(yīng)用、運(yùn)輸?shù)雀鱾€過程提出了善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見及相關(guān)措施。2016年，我國發(fā)布了實(shí)驗(yàn)動物福利相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查指南(征求意見稿)》。《實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查指南(征求意見稿)》規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)、使用過程中福利倫理審查的各項(xiàng)要求，如疼痛管理、安樂死等，將有助于規(guī)范實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查，并指導(dǎo)科研人員采用更有利于實(shí)驗(yàn)動物福利的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)。

3 常用動物麻醉劑使用的福利倫理問題

在動物實(shí)驗(yàn)過程中，麻醉是動物手術(shù)順利進(jìn)行的先決條件。基于倫理及動物福利的考慮，應(yīng)給予實(shí)驗(yàn)動物適當(dāng)?shù)逆?zhèn)靜、麻醉劑以減輕對實(shí)驗(yàn)動物造成的痛苦。動物實(shí)驗(yàn)的麻醉分為不同的類型：按照麻醉途徑可分為吸入麻醉、口服麻醉、皮下或肌肉注射麻醉、腹腔麻醉以及靜脈注射麻醉；按照麻醉部位可分為全身麻醉和局部麻醉；按照用藥的種類可分為單一麻醉和復(fù)合麻醉。不同的麻醉劑及麻醉方式會對實(shí)驗(yàn)動物生理功能產(chǎn)生不同的影響，根據(jù)研究目的科學(xué)地選擇合適的麻醉劑是對科研工作者的基本要求。

3.1吸入性麻醉劑

3.1.1 乙醚(diethyl ether)

乙醚曾是廣泛使用的麻醉劑和動物安樂死藥物，被吸收后會廣泛抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，為高度易揮發(fā)性液體，對呼吸系統(tǒng)有刺激性，可增加呼吸道分泌物。乙醚麻醉過深，可抑制呼吸中樞導(dǎo)致動物死亡。由于其對實(shí)驗(yàn)動物的造成有害作用及可能造成的人員操作危險等原因，目前已不推薦使用[3]。

3.1.2 七氟烷(sevoflurane)

七氟烷為無色透明、芳香無刺激的液體，對呼吸系統(tǒng)刺激小，不易燃易爆，也不與金屬發(fā)生反應(yīng)。七氟烷血?dú)夥峙湎禂?shù)低，誘導(dǎo)期短，麻醉維持期平穩(wěn)，蘇醒快，是一種較為理想的吸入麻醉劑。七氟烷對心血管影響小，且未見明顯的肝損傷，有良好的肌松作用，隨著麻醉的加深會加重呼吸抑制。

研究表明，幼年時期接觸七氟烷會導(dǎo)致成年后空間記憶受損，并且接觸間隔越短，記憶受損越嚴(yán)重[4]。七氟烷可以通過激活GABAA受體，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)；引起B(yǎng)ax和caspase-3表達(dá)增加以及Bcl-2表達(dá)降低，造成神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞退化[5]。另有研究表明，2.5%七氟烷持續(xù)麻醉1～3 h可以改善小鼠空間認(rèn)知能力。該認(rèn)知能力的改善可能與海馬中NR2B水平和p-ERK1/2∶總ERK1/2比值增高有關(guān)。然而，暴露于七氟烷4 h會引起caspase-3激活和凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)毒性[6]。

3.1.3 異氟烷(isoflurane)

異氟烷是目前廣泛使用的吸入麻醉藥，是無色透明的液體，不易燃燒，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，誘導(dǎo)、恢復(fù)和麻醉快速，吸入后80%以上以原形隨呼氣排出，體內(nèi)代謝少，因此，對藥物代謝和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的干擾小。麻醉時有一定的肌松作用，不影響心肌收縮力，對肝、腎、腦也無不良影響。深麻醉時，能引起呼吸抑制。

研究表明，異氟烷麻醉維持動物的心率、血氧分壓、血液pH等生理功能處于穩(wěn)定狀態(tài)[7]，適合情況復(fù)雜且持續(xù)時間較長的動物實(shí)驗(yàn)[8]。異氟烷在多種動物模型中具有抗炎和抗氧化作用。七氟烷和異氟烷預(yù)處理可以抑制大鼠MCAO模型凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[9]。異氟烷在糖尿病大鼠模型中也可發(fā)揮抗氧化作用[10]。異氟烷還可以通過抑制活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)介導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活而減輕內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷[11]。異氟烷麻醉后作用可能導(dǎo)致小鼠注意力缺陷。C57小鼠暴露于1.8%異氟烷2 h，在麻醉7 d后仍顯示潛伏抑制受損，雖然此時腦中剩余的異氟烷少到幾乎可以忽略[12]。

3.2非吸入性麻醉劑

3.2.1 戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)

戊巴比妥鈉屬于中效巴比妥類鎮(zhèn)靜催眠藥，隨用量的增加逐漸產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥作用，大劑量使用時可產(chǎn)生麻醉作用。戊巴比妥鈉通過作為GABA受體激動劑而發(fā)揮麻醉作用[13]，對呼吸中樞有較強(qiáng)的抑制作用，安全范圍較小，麻醉過量易導(dǎo)致動物死亡。

以50 mg/kg劑量腹腔注射麻醉小鼠時，戊巴比妥鈉具有足夠的鎮(zhèn)靜作用，但是鎮(zhèn)痛作用差[14]。如果增加麻醉劑量，例如以70 mg/kg劑量麻醉小鼠，戊巴比妥鈉可以提供足夠的鎮(zhèn)痛作用，但是與之相關(guān)的死亡率風(fēng)險和血流動力學(xué)不穩(wěn)定性增加了[15]。因此，有學(xué)者認(rèn)為巴比妥類藥物只適合終末階段高劑量使用并且不準(zhǔn)用于疼痛控制，除非和阿片類或非甾體類抗炎藥共同使用[3]。

3.2.2 水合氯醛(chloral hydrate)

水合氯醛是一種催眠藥、抗驚厥藥，為白色或無色透明的結(jié)晶，有刺激性氣味。具有鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥作用。較大劑量有抗驚厥作用，大劑量可引起昏迷和麻醉。麻醉過量會導(dǎo)致延髓呼吸中樞抑制，引起死亡。水合氯醛對心血管系統(tǒng)影響大，可引起嚴(yán)重的心律失常[16]。

目前認(rèn)為水合氯醛適合于催眠而非麻醉，動物手術(shù)所需麻醉劑量的水合氯醛不能提供足夠的鎮(zhèn)痛作用[3, 17]，并且還會導(dǎo)致顯著的呼吸抑制。20%的水合氯醛具有很強(qiáng)的刺激性，可能會造成大鼠腸梗阻，腹膜炎以及胃潰瘍等，因此不推薦存活動物實(shí)驗(yàn)使用水合氯醛腹腔麻醉[17]。水合氯醛對實(shí)驗(yàn)動物還具有致突變和致癌作用[18]。此外，水合氯醛曾和硫酸鎂、戊巴比妥鈉聯(lián)合使用作為一種經(jīng)濟(jì)的大動物麻醉和安樂死試劑，但是現(xiàn)在在獸醫(yī)領(lǐng)域已很少用這種方法。根據(jù)美國獸醫(yī)學(xué)會“動物安樂死指南”(AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition)，鑒于水合氯醛嚴(yán)重的副反應(yīng)，水合氯醛也不是合適的安樂死藥物。麻醉學(xué)雜志(Anesthesiology)在2009年就明確表示將竭力關(guān)注動物保護(hù)問題，并且不再發(fā)表使用水合氯醛進(jìn)行麻醉或安樂死的文章。

MCAO模型是研究腦缺血再灌注損傷的動物模型，該動物實(shí)驗(yàn)要求安全有效的麻醉來保證足夠時間完成腦部手術(shù)并能夠快速覺醒，并且基于倫理原因，理想的麻醉劑應(yīng)該具有術(shù)后鎮(zhèn)痛作用。過去，常用麻醉方法便是采用水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，水合氯醛腹腔麻醉具有容易實(shí)現(xiàn)，對心血管功能影響小，并且沒有協(xié)同的神經(jīng)保護(hù)作用等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在，越來越多研究者可能已經(jīng)認(rèn)識到水合氯醛麻醉可能產(chǎn)生的動物倫理問題，而選擇使用其他麻醉劑如異氟烷進(jìn)行麻醉[19-25]，異氟烷麻醉操作比較簡單，能夠快速誘導(dǎo)麻醉和蘇醒，可以達(dá)到足夠的可重復(fù)的麻醉深度，對心血管影響小，并且具有鎮(zhèn)痛作用，滿足動物實(shí)驗(yàn)的倫理標(biāo)準(zhǔn)[18]。但是同時仍有許多采用水合氯醛麻醉[26-31]，其中有的研究對為何選擇水合氯醛麻醉進(jìn)行了特別說明[30]。一些研究采用了水合氯醛與非甾體類抗炎藥聯(lián)合使用[32]。此外，還有一些研究使用了其他麻醉劑，如氯胺酮和甲苯噻嗪[33]，戊巴比妥鈉[34]，或未明確說明麻醉劑名稱及給藥方法[35]。

3.2.3 氯胺酮(ketamine)

氯胺酮是一種作用于大腦皮質(zhì)和脊髓神經(jīng)元的非競爭性NMDA受體拮抗劑[36]。NMDA受體對學(xué)習(xí)和記憶功能有重要作用。氯胺酮廣泛應(yīng)用于所有動物物種的麻醉，還具有鎮(zhèn)痛作用。氯胺酮的多種副作用，包括妄想、幻覺、譫妄和混亂等致使臨床上氯胺酮不再作為主流麻醉劑使用[37]。

氯胺酮不適合單獨(dú)作為手術(shù)麻醉藥物，常與其它麻醉劑聯(lián)合使用[38]。與α-2-腎上腺素能激動劑(甲苯噻嗪)聯(lián)合使用，可增加鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用。與苯二氮平類藥物(地西泮)聯(lián)用可緩解肌肉僵硬癥狀。使用阿托品可以預(yù)防使用氯胺酮導(dǎo)致的唾液分泌物增加和心律失常。

研究表明，氯胺酮具有神經(jīng)毒性，會導(dǎo)致大鼠發(fā)育的大腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[39]，引起腦超氧化物增加[40]，損傷線粒體功能并促進(jìn)大腦超氧化物歧化酶活性[41]，氯胺酮還會抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[42]并干擾其分化[43]。

3.2.4 烏拉坦(urethane，ethyl carbamate)

烏拉坦又稱氨基甲酸乙酯，是一種易逆性膽堿酯酶抑制劑。烏拉坦通過抑制乙酰膽堿酶的活性，造成乙酰膽堿累積干擾正常神經(jīng)傳導(dǎo)而發(fā)揮麻醉作用。此外，烏拉坦可能對其他多個通道具有調(diào)控作用，包括GABAA受體、NMDA受體等[44]。烏拉坦作用持久，麻醉平穩(wěn)，對實(shí)驗(yàn)動物生理變化影響較小，副作用包括具有致癌、骨髓抑制作用等[45]。實(shí)驗(yàn)人員操作時需注意：處理烏拉坦的結(jié)晶或粉末時，需戴口罩、防護(hù)眼鏡和手套，防止吸入和接觸皮膚，并且應(yīng)戴手套處理烏拉坦麻醉動物的血液或血清。

4 討論

近年來，實(shí)驗(yàn)動物麻醉劑使用的倫理問題已越來越引起人們的關(guān)注。在2009年Anesthesiology雜志明確表明將不再發(fā)表使用水合氯醛進(jìn)行麻醉或安樂死的文章，竭力關(guān)注動物保護(hù)問題。從2010年11月起，《心血管研究》(CardiovascularResearch)雜志采取了更為積極的行動，提出了更加嚴(yán)格的動物倫理標(biāo)準(zhǔn)，來保證其所發(fā)表的論文符合國際規(guī)范[3]。新的要求涉及認(rèn)識到動物遭受的疼痛、緩和措施、可能的聯(lián)合用藥，以及可接受的安樂死方法。造成動物疼痛的實(shí)驗(yàn)必須在全麻或局部麻醉的情況下進(jìn)行，并且應(yīng)該使用鎮(zhèn)痛來保證動物遭受的痛苦降至最低。

在動物實(shí)驗(yàn)開始前對各種麻醉劑作用機(jī)制及毒副作用進(jìn)行了解，充分考慮麻醉劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)動物可能造成的影響，根據(jù)研究目的科學(xué)地選擇麻醉劑，不僅可以避免麻醉劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，增加實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，同時又能保證動物實(shí)驗(yàn)的倫理學(xué)要求。因此，我們建議：建立更加科學(xué)、完善的實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查制度；加強(qiáng)研究人員及技術(shù)人員關(guān)于動物福利倫理方面知識的培訓(xùn)，比如在研究生教育階段就增加動物福利倫理方面的課程；加強(qiáng)科研人員與獸醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)動物領(lǐng)域?qū)＜业慕涣鳎m時尋求專業(yè)指導(dǎo)。

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Researchprogressonethicalissuesofanestheticsapplicationinlaboratoryanimals

LI Dan， GUO Yu-ying， DENG Hao， GAO Shan， XU Shi-xin*

(Medical Experiment Center, First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China)

Animal experiments are important methods for scientific research. During animal experiments, it is crucial to select the appropriate anesthetics, not only to ensure the smoothly performed operational procedure and obtaining reliable experimental data, but also to avoid the suffering of laboratory animals and ensure their welfare as more as possible. In recent years, the ethical issues related to laboratory animal welfare have drawn more and more attention. In this review, we briefly discuss the selection of commonly used anesthetics during animal experiments, such as inhaled anesthetics, including diethyl ether, sevoflurane and isoflurane, as well as non-inhaled anesthetics, including pentobarbital sodium, chloral hydrate, ketamine and urethane, and the possibly involved ethical issues related to the application of those anesthetics.

Laboratory animals; Anesthetics; Animal ethics

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0087-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.09.017

2016-12-27

國家自然科學(xué)基金(81373850)。

李丹(1986-)，女，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合。E-mail: plum2006420@163.com

徐士欣(1973-)，女，副主任技師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合。E-mail: xushixintj@163.com