山西省豬鏈球菌的分離鑒定及耐藥性研究

雷宇平 王仲兵 張仲萍 羅甜甜

（山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西太原 030000）

山西省豬鏈球菌的分離鑒定及耐藥性研究

雷宇平 王仲兵 張仲萍 羅甜甜

（山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西太原 030000）

豬鏈球菌（streptococcus suis）作為一種人畜共患的病原可引發(fā)多種疾病，極大的危害了人和動(dòng)物的健康。這種病原體生存范圍廣，繁殖快，對人畜都帶來嚴(yán)重的損失。傳統(tǒng)的鏈球菌分離檢測方法耗時(shí)耗力，隨著生物科學(xué)的發(fā)展，PCR檢測取得了矚目的成績，不僅能夠使我們直觀的了解其毒力特性，還能為臨床治療以及疫病預(yù)防提供科學(xué)的依據(jù)。本文對山西省豬鏈球菌做了分離鑒定并對耐藥性進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

豬鏈球菌 分離 鑒定 耐藥性

豬鏈球菌不僅能在豬群中引發(fā)敗血癥、腦膜炎、支氣管炎等疾病，還會(huì)導(dǎo)致孕豬流產(chǎn)、胎豬畸型等，使養(yǎng)豬業(yè)承受巨大經(jīng)濟(jì)損失。豬鏈球菌共有血清1-34型和1/2型共35種。其中，血清2型的毒性最強(qiáng)，也是我國最主要和最流行的致病型血清。在20世紀(jì)末，我國江蘇省就暴發(fā)了豬鏈球菌引起的流行性SS2，導(dǎo)致大量豬和工作人員感染死亡，2006年夏天，我國四川省再度暴發(fā)SS2，不僅經(jīng)濟(jì)損失慘重，也威脅到了人類公共衛(wèi)生安全。雖然抗生素的治療豬鏈球菌的良好辦法，但由于不專業(yè)的操作和科學(xué)意識的薄弱使得抗生素濫用情況普遍，動(dòng)物體內(nèi)的耐藥菌近年來大幅增加。本研究從山西省11個(gè)市15個(gè)豬場采集病死豬（疑似豬鏈球菌感染的發(fā)病豬）的扁桃體、脾臟以及腎臟等臟器，通過觀察菌落形態(tài)以及PCR來對其進(jìn)行鑒定。當(dāng)確定其為豬鏈球菌后，對其進(jìn)行藥物敏感測試，分析山西地區(qū)豬鏈球菌的耐藥性，以便為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

病料來自山西省11個(gè)市15個(gè)豬場中臨床癥狀疑似2型豬鏈球菌感染發(fā)病豬的臟器和全血，并經(jīng)過分離得到2型豬鏈球菌，標(biāo)準(zhǔn)參考菌株為HA9801，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)系王志梅老師提供。

1.2 儀器

研究所需的PCR擴(kuò)增試劑、PMD18-T載體和DNA maker購自北京博凌科為生物科技有限公司，THB培養(yǎng)基購自TaKaRa公司，醫(yī)用凈化工作臺購自天津?qū)嶒?yàn)儀器設(shè)備廠，凝膠圖像處理系統(tǒng)產(chǎn)自上海天能生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

首先，豬鏈球菌病的分離鑒定要先進(jìn)行分離培養(yǎng)純化。采用無菌手段采集被2型豬鏈球菌感染的豬的全血和臟器，將其在瓊脂平皿上進(jìn)行劃線分離，蓋上蓋子將其倒置于37℃的保溫箱中約20h，在此期間，要對菌落的形態(tài)和變化趨勢進(jìn)行觀察，看其是否形成灰白色半透明狀的凸起菌落。然后，對照染色鏡檢，看是否形成圓形成對的短鏈排列陽性球菌，若血平板顯示為α溶血，則表示鑒定為2型豬鏈球菌落。將其移至THB液體培養(yǎng)基中，對其進(jìn)行24h37℃增菌培養(yǎng)，完成后再次進(jìn)行染色鏡檢，對培養(yǎng)液體無雜菌者選出進(jìn)行保存。

其次，進(jìn)行PCR 的鑒定。SS2的檢測需要16SrRNA保守區(qū)、GDH、CPS等基因設(shè)計(jì)來共同完成。作為當(dāng)前世界上公認(rèn)的強(qiáng)毒力因子，CPS基因設(shè)計(jì)引物根據(jù)其獨(dú)有的方法，能夠準(zhǔn)確鑒定1、 2、9、14和1/2型菌株。由于GDH是一種免疫原型蛋白，其保守型和突變率都很低，也是其成為SS2鑒定依據(jù)的重要原因。具體操作方法如下：在培養(yǎng)液中提取基因組為模板，將其配置到PCR反應(yīng)液中，即PCR M IX 12.5 μl。加入游引物1μl，模板2μl，ddH2O至25μl。用凈含量為1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并將PCR試劑回收至膠盒中。

耐藥性的測定采用了5種臨床上應(yīng)用于豬鏈球菌常見的抗菌藥，如慶大霉素、氯霉素、丙環(huán)沙星、阿莫西林和磺胺甲唑。將2型豬鏈球菌的分離株在心腦培養(yǎng)液中進(jìn)行接種，將溫度設(shè)定為37℃，菌液濁度為1×10nCFU/ml，并用生理鹽水進(jìn)行稀釋，比例為1：800。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏡檢結(jié)果

在該試驗(yàn)中，分離的菌株與2型豬鏈球菌分離培養(yǎng)結(jié)果一致，都是光滑的灰白色隆起透明的小菌落，經(jīng)觀察，在培養(yǎng)液中，靜止12h后，培養(yǎng)基下方開始變渾濁，底部有黏稠菌體沉淀，形狀不規(guī)則。對其進(jìn)行染色鏡檢后，確定其為2型豬鏈球菌菌體。

2.2 PCR鑒定結(jié)果

為進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和科學(xué)性，采用了GDH毒力因子對其進(jìn)一步篩選。將一部分2型豬鏈球菌進(jìn)行擴(kuò)增回收測序，發(fā)現(xiàn)其與其他GDH基因序列的同源性達(dá)98%，與NCBI的CPS2J基因序列同源性達(dá)99%。

2.3 耐藥性鑒定結(jié)果

測試結(jié)果表明，山西該地 豬鏈球菌對5種藥物的耐藥性分別為71%、82%、55%、53%、69%。其中，對氯霉素的耐藥性最高，其次為青霉素類藥物。

3 結(jié)語

通過本次研究發(fā)現(xiàn)山西地區(qū)疑似豬鏈球菌感染主要是2型豬鏈球菌菌體。在現(xiàn)代化養(yǎng)豬場中，豬鏈球菌已成為最主要的傳染病源之一，其疫苗免疫也成為常規(guī)免疫程序，但疫苗的應(yīng)用效果有待提高。同時(shí)，豬鏈球菌的耐藥性不斷增加，給治療帶來了一定難度。臨床工作者在治療過程中不得盲目用藥，最好先進(jìn)行敏感測試，再進(jìn)行抗感治療。

[1]王紅寶，李紅麗，郭雪麗.山西省致病性豬鏈球菌毒力基因測定及耐藥性監(jiān)測[J].養(yǎng)豬，2015，（6）：113-115.

[2]黃碧蓮.豬鏈球菌病病原分離鑒定及防治試驗(yàn)[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2016，（14）：206.

∶山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目

項(xiàng)目名稱∶豬鏈球菌病綜合防控技術(shù)研究

項(xiàng)目編號∶201603D221023-3