沙棘籽油對(duì)肺孢子蟲(chóng)肺炎大鼠免疫功能的影響*

陳建芳，閆 艷，高 靜，于桂霞，周 蕾

(包頭醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭014060)

沙棘籽油對(duì)肺孢子蟲(chóng)肺炎大鼠免疫功能的影響*

陳建芳，閆 艷，高 靜，于桂霞，周 蕾

(包頭醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭014060)

目的:探討沙棘籽油對(duì)肺孢子蟲(chóng)肺炎(pneumocystis pneumonia，PCP)大鼠免疫功能的影響，為沙棘籽油的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法:用地塞米松建立大鼠PCP動(dòng)物模型，觀察沙棘籽油對(duì)其免疫器官指數(shù)的影響，觀察沙棘籽油對(duì)其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，通過(guò)溶血空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其抗體形成細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果:沙棘籽油能增加PCP大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，提高PCP大鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力和抗體形成細(xì)胞數(shù)量。結(jié)論:沙棘籽油可增強(qiáng)PCP大鼠的免疫功能。

沙棘籽油;肺孢子蟲(chóng)肺炎;大鼠;免疫功能

肺孢子蟲(chóng)肺炎(pneumocystis pneumonia，PCP)是免疫缺陷者的常見(jiàn)感染性疾病，多見(jiàn)于艾滋病、器官移植、長(zhǎng)期大量應(yīng)用免疫抑制劑者，其病原體肺孢子蟲(chóng)在正常宿主體內(nèi)呈隱性感染狀態(tài)，當(dāng)免疫功能下降或受損時(shí)增殖而致病，甚至導(dǎo)致宿主死亡［1］。目前臨床用于治療PCP的主要藥物為復(fù)方新諾明、戊烷脒等，雖然療效較好，但某些患者存在嚴(yán)重的副作用或耐藥性，因此，尋求新的高效低毒的抗肺孢子蟲(chóng)藥物成為研究焦點(diǎn)之一。沙棘作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有高效、生長(zhǎng)廣泛、無(wú)毒副作用的優(yōu)勢(shì)，在治療心血管疾病、抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［2］。沙棘籽油從沙棘的種子中提取，含有維生素C、維生素E、黃酮、多酚等多種生物活性物質(zhì)，對(duì)心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等具有廣泛的藥理作用，還具有抗氧化、抗放射、抗炎、抗過(guò)敏等作用［3］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察沙棘籽油對(duì)PCP大鼠免疫功能的影響，以期為臨床防治PCP提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Wistar大鼠，體重180～220 g，購(gòu)自本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，5只/籠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周開(kāi)始試驗(yàn)，清潔環(huán)境下飼養(yǎng)，喂飼按標(biāo)準(zhǔn)配方配制的普通顆粒飼料，不限制飲水量，7 d更換1次墊料。

1.1.2 主要試劑 沙棘籽油(內(nèi)蒙古宇航人科技有限公司，批號(hào)120812);地塞米松磷酸鈉注射液(鄭州卓峰制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)130217);四環(huán)素(內(nèi)蒙古赤峰蒙欣藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)130301)。

1.2 方法

1.2.1 PCP模型的建立 按參考文獻(xiàn)［4］建立大鼠PCP動(dòng)物模型。在大鼠腹股溝皮下注射地塞米松磷酸鈉2 mg/次，2次/周，連續(xù)6周，同時(shí)在飲水中加入1 mg/mL四環(huán)素以預(yù)防繼發(fā)性細(xì)菌感染。連續(xù)注射地塞米松磷酸鈉6周后隨機(jī)選取2只大鼠處死，制作肺組織印片，用吉姆薩染液染色，鏡檢見(jiàn)肺孢子蟲(chóng)包囊，證明PCP模型建立成功。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，因造模大鼠免疫能力下降，除正常對(duì)照組外，PCP模型組和沙棘籽油治療組各死亡2只、沙棘籽油預(yù)防組死亡1只。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 隨機(jī)分為對(duì)照組、PCP模型組、沙棘籽油預(yù)防組和沙棘籽油治療組4組，10只/組。除對(duì)照組外，其余3組均用地塞米松造模，PCP模型組不給任何治療藥物。沙棘籽油預(yù)防組在造模第1周開(kāi)始，同時(shí)用沙棘籽油連續(xù)灌胃6周，1 mL/只，每周3次，連續(xù)6周;沙棘籽油治療組在造模第7周開(kāi)始用沙棘籽油連續(xù)灌胃1周，2 mL/只，1次/d;其余2組用等量生理鹽水灌胃。各組在試驗(yàn)第8周采集胸腺、脾臟、血液、腹腔液等標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)。

1.2.3 免疫器官指數(shù)測(cè)定 試驗(yàn)前稱量大鼠體重，在進(jìn)行腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)的同時(shí)，取大鼠的胸腺和脾臟，用濾紙吸干稱重，以胸腺或脾臟重量(mg)與體重(g)之比計(jì)算出胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。

1.2.4 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定 試驗(yàn)前3 d向大鼠腹腔注射無(wú)菌肉湯2 mL，試驗(yàn)前向大鼠腹腔注射2%的雞紅細(xì)胞懸液1 mL，輕揉腹部。30 min注射Hanks液2 mL，輕揉腹部，脫頸處死大鼠，從腹腔中吸取腹腔液涂片，瑞氏染色后鏡檢，計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，并計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬百分率。

1.2.5 抗體形成細(xì)胞數(shù)量測(cè)定 采用溶血空斑試驗(yàn)，將大鼠經(jīng)腹腔無(wú)菌注射10%綿羊紅細(xì)胞懸液1 mL，免疫后4 d脫頸處死大鼠，剖腹取脾，放入加Hanks液平皿內(nèi)，剪碎研磨過(guò)濾，制成5×106/mL脾細(xì)胞懸液。取脾細(xì)胞懸液0.1 mL、補(bǔ)體0.1 mL、20%綿羊紅細(xì)胞懸液0.1 mL、Hanks液0.7 mL混勻后加入玻片小室內(nèi)，用凡士林封口。置于37℃溫箱中孵育1～1.5 h。肉眼計(jì)數(shù)玻片小室內(nèi)的溶血空斑數(shù)量，即抗體形成細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以表示，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 沙棘籽油對(duì)大鼠免疫器官指數(shù)的影響 PCP模型組大鼠免疫器官指數(shù)低于對(duì)照組(P＜0.05)，提示地塞米松抑制大鼠免疫功能致免疫器官萎縮;與PCP模型組相比，沙棘籽油預(yù)防組和治療組大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均升高(P＜0.05);預(yù)防組和治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示沙棘籽油能增加PCP大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。見(jiàn)表1。

表1 沙棘籽油對(duì)大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(±s)

表1 沙棘籽油對(duì)大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(±s)

a為與對(duì)照組相比P＜0.05，b為與PCP模型組相比P＜0.05

組別 n 胸腺指數(shù)(mg/g) 脾臟指數(shù)(mg/g) 10 0.98±0.11 4.43±0.96 PCP模型組 8 0.45±0.09a 3.01±1.03a沙棘籽油預(yù)防組 9 0.92±0.16b 4.23±1.05b沙棘籽油治療組 8 0.80±0.18b 4.07±0.82對(duì)照組b

2.2 沙棘籽油對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 PCP模型組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率低于對(duì)照組(P＜0.05)，提示地塞米松可抑制大鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能;與PCP模型組相比，沙棘籽油預(yù)防組和治療組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率均升高(P＜0.05);預(yù)防組和治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示沙棘籽油可增強(qiáng)PCP大鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能。見(jiàn)表2。

表2 沙棘籽油對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(±s)

表2 沙棘籽油對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(±s)

a為與對(duì)照組相比P＜0.05，b為與PCP模型組相比P＜0.05

組別 n 巨噬細(xì)胞吞噬百分率(%) 10 51.70±5.48 PCP模型組 8 37.63±3.66a沙棘籽油預(yù)防組 9 49.56±6.97b沙棘籽油治療組 8 44.25±4.83對(duì)照組b

2.3 沙棘籽油對(duì)大鼠抗體形成細(xì)胞數(shù)量的影響 PCP模型組大鼠溶血空斑數(shù)量低于對(duì)照組(P＜0.05)，提示地塞米松可降低抗體形成細(xì)胞數(shù)量;與PCP模型組相比，沙棘籽油預(yù)防組和治療組大鼠溶血空斑數(shù)量均增加(P＜0.05);預(yù)防組和治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，預(yù)防組高于治療組(P＜0.05)，提示沙棘籽油可提高大鼠的抗體形成細(xì)胞數(shù)量，預(yù)防組效果強(qiáng)于治療組。見(jiàn)表3。

表3 沙棘籽油對(duì)大鼠抗體形成細(xì)胞數(shù)量的影響(±s)

表3 沙棘籽油對(duì)大鼠抗體形成細(xì)胞數(shù)量的影響(±s)

a為與對(duì)照組相比P＜0.05，b為與PCP模型組相比P＜0.05，c為與沙棘籽油預(yù)防組相比P＜0.05

組別 n 溶血空斑數(shù)(個(gè)/106脾細(xì)胞) 10 353.50±65.32 PCP模型組 8 97.50±38.73a沙棘籽油預(yù)防組 9 279.44±68.71b沙棘籽油治療組 8 213.13±30.58對(duì)照組bc

3 討論

3.1 沙棘籽油能提高大鼠免疫器官指數(shù) 免疫器官是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其發(fā)育情況直接影響機(jī)體的免疫功能。通過(guò)測(cè)定大鼠免疫器官的重量，可初步反映對(duì)機(jī)體免疫功能的影響［5］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，PCP模型組大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)低于對(duì)照組，沙棘籽油預(yù)防組和治療組大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與PCP模型組相比均升高，說(shuō)明地塞米松可抑制大鼠免疫器官的發(fā)育，沙棘籽油能增加PCP大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，沙棘籽油可通過(guò)對(duì)免疫器官的作用起到調(diào)節(jié)免疫功能的作用。

3.2 沙棘籽油能增強(qiáng)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能巨噬細(xì)胞在體內(nèi)具有非特異性吞噬作用及抗原提呈作用。本試驗(yàn)試圖探討沙棘籽油對(duì)巨噬細(xì)胞是否具有免疫促進(jìn)作用，通過(guò)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞來(lái)反映巨噬細(xì)胞的吞噬能力。結(jié)果表明，PCP模型組大鼠巨噬細(xì)胞吞噬率低于對(duì)照組，與PCP模型組相比，沙棘籽油預(yù)防組和治療組大鼠巨噬細(xì)胞吞噬率均增高，說(shuō)明地塞米松致大鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能下降，沙棘籽油能增強(qiáng)大鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能，提示沙棘籽油具有對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫促進(jìn)作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能。

3.3 沙棘籽油能提高大鼠抗體形成細(xì)胞數(shù)量 抗體是體液免疫應(yīng)答的重要效應(yīng)分子，與相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。通過(guò)溶血空斑試驗(yàn)檢測(cè)脾中抗體形成細(xì)胞的數(shù)量，可推算出分泌特異性抗體的B細(xì)胞數(shù)量，從而反映機(jī)體體液免疫功能狀態(tài)。有研究表明，沙棘提取物可提高小鼠脾臟中抗體生成細(xì)胞數(shù)量、提高血清中抗體IgG、IgA、IgM及補(bǔ)體C3、C4水平［6］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，PCP模型組大鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)量低于對(duì)照組，說(shuō)明地塞米松致大鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)量降低;與模型對(duì)照組相比，沙棘籽油預(yù)防組和治療組抗體生成細(xì)胞數(shù)量均升高，沙棘籽油對(duì)PCP大鼠的預(yù)防效果強(qiáng)于治療效果，提示沙棘籽油可提高地塞米松致免疫功能低下大鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)量，表明沙棘籽油具有增強(qiáng)機(jī)體體液免疫功能的作用。

本研究結(jié)果證明，沙棘籽油可提高PCP大鼠免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)其腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高其抗體產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)量，提示沙棘籽油有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，可用于PCP的預(yù)防和治療，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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2015-09-22)

包頭市醫(yī)藥衛(wèi)生基金(2011S2012-07-6)